概要

Erfolgreiche In-vivo-Calcium-Bildgebung mit einem kopfmontierten Miniaturmikroskop in der Amygdala der frei verhaltenden Maus

Published: August 26, 2020
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概要

In vivo mikroendoskopische Kalzium-Bildgebung ist ein unschätzbares Werkzeug, das Echtzeit-Überwachung von neuronalen Aktivitäten bei frei verhaltenden Tieren ermöglicht. Jedoch, Anwendung dieser Technik auf die Amygdala war schwierig. Dieses Protokoll soll eine nützliche Leitlinie für die erfolgreiche Ausrichtung auf Amygdala-Zellen mit einem miniaturisierten Mikroskop bei Mäusen bieten.

Abstract

In vivo Echtzeit-Überwachung von neuronalen Aktivitäten bei frei beweglichen Tieren ist einer der wichtigsten Ansätze, um neuronale Aktivität mit Verhalten zu verknüpfen. Zu diesem Zweck wurde eine in vivo-Bildgebungstechnik entwickelt, die Kalziumtransienten in Neuronen mithilfe genetisch kodierter Calciumindikatoren (GECIs), eines miniaturisierten Fluoreszenzmikroskops und einer Gradienten-Refraktiven-Index-Linse (GRIN) erkennt und erfolgreich auf viele Gehirnstrukturen1,2,3,4,5,6angewendet. Diese bildgebende Technik ist besonders leistungsfähig, da sie eine chronische simultane Bildgebung genetisch definierter Zellpopulationen über einen längeren Zeitraum bis zu mehreren Wochen ermöglicht. Obwohl nützlich, diese bildgebende Technik wurde nicht leicht auf Gehirnstrukturen angewendet, die tief im Gehirn wie Amygdala, eine wesentliche Gehirnstruktur für emotionale Verarbeitung und assoziative Angst Gedächtnis7lokalisieren. Es gibt mehrere Faktoren, die es schwierig machen, die bildgebende Technik auf die Amygdala anzuwenden. Zum Beispiel treten Bewegungsartefakte in der Regel häufiger während der Bildgebung in den tieferen Hirnregionen auf, weil ein tief in das Gehirn implantiertes Kopf-Mount-Mikroskop relativ instabil ist. Ein weiteres Problem ist, dass der seitliche Ventrikel in der Nähe der implantierten GRIN-Linse positioniert ist und seine Bewegung während der Atmung zu hochunregelmäßigen Bewegungsartefakten führen kann, die nicht leicht korrigiert werden können, was es schwierig macht, eine stabile bildgebende Ansicht zu bilden. Da die Zellen in der Amygdala in der Regel in einem ruhenden oder anästhesierten Zustand ruhig sind, ist es schwierig, die Zielzellen, die GECI in der Amygdala exzieren, während des Baseplating-Verfahrens für eine spätere Bildgebung zu finden und zu fokussieren. Dieses Protokoll bietet eine hilfreiche Anleitung, wie zellen, die GECI in der Amygdala exemiten, effizient mit einem miniaturisierten Mikroskop mit Kopfmontage für eine erfolgreiche In-vivo-Calcium-Bildgebung in einer so tieferen Hirnregion gezielt werden können. Es wird darauf hingewiesen, dass dieses Protokoll auf einem bestimmten System (z. B. Inscopix) basiert, aber nicht darauf beschränkt ist.

Introduction

Kalzium ist ein allgegenwärtiger zweiter Botenstoff, der eine entscheidende Rolle in fast allen Zellfunktionen spielt8. In Neuronen führen Aktionspotentialabschuss und synaptische Sendeleistung zu einer schnellen Veränderung der intrazellulären freien [Ca2+]9,10. Daher bietet die Verfolgung von Kalziumtransienten die Möglichkeit, die neuronale Aktivität zu überwachen. GECIs sind leistungsstarke Werkzeuge, die die Überwachung [Ca2+] in definierten Zellpopulationen und intrazellulären Kompartimenten11,12ermöglichen. Unter vielen verschiedenen Arten von proteinbasiertem Kalziumindikator ist GCaMP, eine Ca2+-Sonde, die auf einem einzigen GFP-Molekül13basiert, die am meisten optimierte und daher am weitesten verbreitete GECI. Durch mehrere Runden des Engineerings wurde eine Reihe von Varianten von GCaMP entwickelt12,14,15,16. Wir verwenden einen der kürzlich entwickelten GCaMPs, GCaMP7b, in diesem Protokoll16. GCaMP-Sensoren haben wesentlich zur Untersuchung der Funktionen des neuronalen Schaltkreises in einer Reihe von Modellorganismen beigetragen, wie z. B. der Abbildung von Ca2+ Transienten während der Entwicklung17, in vivo Bildgebung in einer spezifischen kortikalen Schicht18, Messung der Schaltungsdynamik im Motoraufgabenlernen19 und Bildgebung der Zellensembleaktivität im Zusammenhang mit assoziativem Angstgedächtnis im Hippocampus und Amygdala20,21.

Optische Bildgebung von GECIs hat mehrere Vorteile22. Die genetische Codierung ermöglicht es, GECIs für einen längeren Zeitraum stabil in einer bestimmten Teilmenge von Zellen zu exprimieren, die durch genetisches Profil oder spezifische Muster anatomischer Konnektivität definiert sind. Optische Bildgebung ermöglicht in vivo chronische simultane Überwachung von Hunderten bis Tausenden von Neuronen bei lebenden Tieren. Einige optische Bildgebungssysteme wurden für die In-vivo-Bildgebung und Analyse von GECIs im Gehirn frei verhaltender Mäuse mit miniaturisierten Fluoreszenzmikroskopen21,23,24,25entwickelt. Obwohl die optische Bildgebungstechnik in vivo, die auf GECIs, GRIN-Objektiv und einem Head-Mount-Miniaturmikroskop basiert, ein leistungsfähiges Werkzeug ist, um den Zusammenhang zwischen neuronaler Schaltkreisaktivität und Verhalten zu untersuchen, war die Anwendung dieser Technologie auf die Amygdala aufgrund mehrerer technischer Probleme im Zusammenhang mit der Ausrichtung der GRIN-Linse auf Zellen, die GECIs in der Amygdala exzieren, ohne Bewegungsartefakte zu verursachen, die die Qualität der Bildaufnahme stark reduzieren und Zellen finden, die GECIs exdrücken. Dieses Protokoll soll eine hilfreiche Richtlinie für chirurgische Verfahren der Baseplate-Anhaftung und GRIN-Linsenimplantation bieten, die entscheidende Schritte für eine erfolgreiche optische Kalzium-Bildgebung in vivo in der Amygdala sind. Obwohl dieses Protokoll auf die Amygdala abzielt, sind die meisten hier beschriebenen Verfahren allgemein auf andere tiefere Hirnregionen anwendbar. Obwohl dieses Protokoll auf einem bestimmten System (z. B. Inscopix) basiert, kann derselbe Zweck leicht mit anderen alternativen Systemen erreicht werden.

Protocol

Alle Verfahren wurden von der Animal Ethics Committee am Korea Advanced Institute of Science and Technology genehmigt. Alle Experimente wurden in Übereinstimmung mit der Leitlinie des Institutionellen Ausschusses für Tierpflege und -nutzung durchgeführt. HINWEIS: Dieses Protokoll besteht aus sechs Hauptschritten: Virusinjektionschirurgie, GRIN-Linsenimplantatchirurgie, Validierung der GRIN-Linsenimplantation, Baseplattenbefestigung, optische Aufzeichnung des GCaMP-Signals während eines Ver…

Representative Results

Validierung der GRIN-LinsenimplantationBevor die Grundplatte chronisch durch Zementieren am Gehirn befestigt wird, muss die GRIN-Linsenimplantation validiert werden. Bei Tieren mit erfolgreicher Linsenimplantation wurden sowohl GCaMP-Extierzellen als auch Blutgefäße innerhalb eines Fokalebenenbereichs deutlich beobachtet, der durch den Abstand zwischen objektiver Linse des Mikroskops und implantierter GRIN-Linse bestimmt wurde (Abbildung 2Aund…

Discussion

Geschickte Operationstechniken sind unerlässlich, um eine erfolgreiche optische Kalzium-Bildgebung in vivo mit Kopf-Mount-Miniaturmikroskopie in tieferen Hirnregionen wie der Amygdala zu erreichen, wie wir sie hier beschrieben haben. Obwohl dieses Protokoll eine Richtlinie für optimierte chirurgische Prozesse der Grundplattenbefestigung und der GRIN-Linsenimplantation bietet, können zusätzliche Optimierungsprozesse für kritische Schritte erforderlich sein. Wie im Protokollabschnitt erwähnt, müssen Amygdala-Koordin…

開示

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Diese Arbeit wurde durch Stipendien der Samsung Science and Technology Foundation (Projektnummer SSTF-BA1801-10) unterstützt.

Materials

26G needle BD 302002 Surgery
AAV1-Syn-GCaMP7b-WPRE Addgene 104493-AAV1 Surgery
AAV2/1-CaMKiiα-GFP custom made Surgery
Acrylic-Dental cement (Ortho-jet Acrylic Pink) Lang 1334-pink Surgery & Baseplate Attachment
Air flow manipulator Neurotar NTR000253-04 Baseplate Attachment
Amoxicillin SIGMA A8523-5G Surgery
Baseplate INSCOPIX 1050-002192 Baseplate Attachment
Baseplate cover INSCOPIX 1050-002193 Baseplate Attachment
Behavioral apparatus (chamber) Coulbourn Instrument Testcage Behavior test
Behavioral apparatus (software) Coulbourn Instrument Freeze Frame Behavior test
Carbon cage Neurotar 180mm x 70mm Baseplate Attachment
Carprofen SIGMA PHR1452-1G Surgery
Data processing software INSCOPIX INSCOPIX Data Processing Software Baseplate Attachment & Behavior test
Dexamethasone SIGMA D1756-500MG Surgery
Drill Seyang marathon-4 Surgery
Drill bur ELA US1/2, Shank104 Surgery
Glass needle WPI PG10165-4 Surgery
GRIN lens (INSCOPIX Proview Lens Probe) INSCOPIX 1050-002208 Surgery
Hamilton Syringe Hamilton 84875 Surgery
Head plate Neurotar Model 5 Surgery
Hex-key INSCOPIX 1050-004195 Baseplate Attachment
Laptop computer Samsung NT950XBV Surgery & Baseplate Attachment
Lens holder, Stereotaxic rod (INSCOPIX proview implant kit) INSCOPIX 1050-004223 Surgery
Microscope gripper INSCOPIX 1050-002199 Baseplate Attachment
Microscope, DAQ software, hardware INSCOPIX nVista 3.0 Baseplate Attachment & Behavior test
Mobile homecage Neurotar MHC V5 Baseplate Attachment
Moterized arm Neurostar Customized Surgery
Moterized arm software Neurostar Customized Surgery
NI board National instrument Behavior test
Removable epoxy bond WPI Kwik-Cast Surgery
Resin cement (Super-bond) Sun medical Super bond C&B Surgery
Skull screw Stoelting 51457 Surgery
Stereotaxic electrode holder ASI EH-600 Surgery
Stereotaxic frame Stoelting 51600 Surgery
Stereotaxic manipulator Stoelting 51600 Baseplate Attachment

参考文献

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記事を引用
Lee, H., Han, J. Successful In vivo Calcium Imaging with a Head-Mount Miniaturized Microscope in the Amygdala of Freely Behaving Mouse. J. Vis. Exp. (162), e61659, doi:10.3791/61659 (2020).

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