Qui presentiamo un protocollo per misurare i flussi in vitro di Ca2 nei neuroni midbrain e i loro effetti a valle sulla caspase-3 utilizzando colture midbrain topo primario. Questo modello può essere utilizzato per studiare i cambiamenti patofsiologici legati all’attività anormale di Ca2 nei neuroni midbrain e per lo screening di nuove terapie per le proprietà anti-apoptotiche.
Il morbo di Parkinson (PD) è un disturbo neurodegenerativo devastante causato dalla degenerazione dei neuroni dopaminergici (DA). L’eccessivo afflusso di Ca2 a causa dell’attivazione anomala dei recettori del glutammato si traduce in accitotossicità DA ed è stato identificato come un importante meccanismo per la perdita di neurone DA. In questo studio, isoliamo, dissociamo e coltura i neuroni midbrain dal mesencephalon ventrale del topo (VM) degli embrioni di topo ED14. Infettamo quindi le colture midbrain del topo primario a lungo termine con un virus associato all’adeno (AAV) che esprime un indicatore di calcio geneticamente codificato, GCaMP6f sotto il controllo del promotore di sinapsin specifico del neurone umano, hSyn. Utilizzando l’imaging confocale dal vivo, mostriamo che i neuroni midbrain murini di topo se nerici colturati mostrano iflussimenti spontanei di Ca 2 e rilevati da AAV-hSyn-GCaMP6f. L’applicazione del bagno di glutammato a colture midbrain provoca elevazioni anomale nella Ca2 all’interno dei neuroni e questo è accompagnato dall’attivazione del caspase-3 nei neuroni DA, come dimostrato dall’immunosostenimento. Le tecniche per identificare l’apoptosi mediata dal glutammato nei neuroni DA del topo primario hanno importanti applicazioni per lo screening ad alto contenuto di farmaci che preservano la salute dei neuroni DA.
Il morbo di Parkinson (PD) è il secondo disturbo neurodegenerativo più comune al mondo, senza una cura nota. Le stime suggeriscono che la prevalenza della PD continuerà ad aumentare e si prevede che supererà 1 milione di diagnosi entro il 2030 solo negli Stati Uniti1. Con pochi trattamenti efficaci attualmente disponibili per combattere la PD, c’è una pressante necessità di sviluppare terapie più efficaci. PD è caratterizzato da una rapida e progressiva perdita di neuroni dopamina midbrain (DA)2. I meccanismi che sono alla base della neurodegenerazione nella PD sono poco compresi. Le prove suggeriscono una probabile convergenza di più meccanismi, come lo stress ossidativo e la disfunzione mitocondriale, ecc. che contribuiscono all’avvio di cascate di segnalazione apoptotica e alla morte finaledelle cellule 3.
Uno di questi meccanismi convergenti, l’ecitotossicità mediata dal glutammato è stato implicato in molteplici malattie neurodegenerative, tra cui PD4. Mentre si pensa che l’ecitotossicità mediata dal glutammato funzioni principalmente attraverso la stimolazione dei recettori NMDA attraverso un aumento eccessivo della concentrazione intracellulare di Ca2 e l’eventuale inizio dell’apoptosi, anche i recettori AMPA permeabili ca2sono stati implicati nella risposta excitotossica5,6,7. Pertanto, è interessante determinare il contributo dei recettori AMPA all’apoptosi mediata dal glutammato all’interno di un modello PD. Questo può essere ottenuto utilizzando NBQX, un AMPA e kainate blocker, che a concentrazioni di micromolari è selettivo per i recettori AMPA8. L’ecitotossicità mediata dal glutammato e le cascate di segnalazione apoptotica sono un bersaglio a valle ideale per misurare l’entità della morte cellulare e un potenziale obiettivo per l’intervento terapeutico. Pertanto, lo sviluppo di un metodo ad alto contenuto per valutare la modulazione mediata dal glutammato dell’attività del calcio e la segnalazione a valle associata nei neuroni mesencephalici ventrali (VM) primari sarebbe utile per lo screening di nuovi metodi di trattamento sulla loro capacità di preservare la salute neuronale.
Qui, abbiamo sviluppato un protocollo in cui esprimiamo l’indicatore di calcio geneticamente codificato (GECI), GCaMP6f, utilizzando AAV2/5 con la promotore della sinasi umana (hSyn) per misurarel’attività Ca 2 dei neuroni primari della VM del topo in risposta all’applicazione del glutammato che può essere misurata a livello fisiologico e molecolare. Questo screening ad alto contenuto può essere adattato per scoprire prodotti farmaceutici o trattamenti che modulano l’attività di Ca2 per preservare la salute dei neuroni vm. Proponiamo che questo modello di coltura primaria sia un modo efficace per controllare nuovi interventi pd, in base alla loro capacità di preservare la salute dei neuroni VM e mitigare la progressione della PD.
Descriviamo un sistema di coltura cellulare ventrale primaria a lungo termine (VM) per l’analisi ad alto contenuto dell’apoptosi mediata dal glutammato nei neuroni. Gli studi hanno impiegato colture dopaminergiche midbrain primarie per chiarire i meccanismi eccitatotossici nel contesto dei modelli PD11,12. In questo studio, impieghiamo un approccio combinatorio utilizzando indicatori di calcio codificati geneticamente (GECI) per misurarel’attività di Ca 2 e associare ulteriormente questa attività ai cambiamenti molecolari a valle, come l’avvio di cascate di segnalazione apoptotica4. Il metodo presenta molteplici vantaggi rispetto ad altri sistemi di coltura cellulare simili. Poiché abbiamo un particolare interesse per l’eccitatotossicità nel contesto del morbo di Parkinson, l’uso di colture cellulari VM primarie è l’ideale. Utilizzando diverse tecniche di rilocazione del campo, come i puntini di copertura grigliati o uno stadio di microscopio XY motorizzato combinato con l’immunostaining TH, possiamo studiare direttamente gli effetti specifici del tipo di cellula dell’apoptosi mediata dal glutammato nei neuroni midbrain ventrali. Inoltre, il modello di coltura cellulare di 3 settimane consente ai neuroni di sviluppare il loro profilo molecolare completo e maturo, riflettendo i neuroni DAadulti 9. I metodi precedenti si sono concentrati principalmente sui cambiamenti molecolari a seguito dell’ecitototossicità mediata dal glutammato13,14. Il modello è unico nella sua capacità di correlare i cambiamenti acuti nella fisiologia neuronale con gli eventi molecolari a valle nei tipi di cellule identificati. Una limitazione del modello di coltura primaria è che la tecnica di dissezione cattura l’intero midbrain ventrale, compresi i neuroni DA e GABAergic così come i neuroni dalla SNc e VTA. Le prove suggeriscono ora che i neuroni DA della SNc hanno vulnerabilità selettiva al calcio e alla morte delle cellule rispetto ai neuroni DA della vicina VTA15. Sfortunatamente, differenziare la SNc dai neuroni VTA nelle colture embrionali si è dimostrata difficile con pochi punti di riferimento anatomici per definire queste strutture nel cervello embrionale.
Dimostriamo che la tecnica di coltura primaria consente la quantificazione dell’attività spontanea eterogenea di Ca2 (Figura 1). Pertanto, questo è un modello di sistema di coltura cellulare ideale per studiare le cellule tonicamente attive, come i neuroni dopaminergici che making del midbrain, neuroni neocorticali, e neuroni GABaergic del nucleo soprachiasmatico (SCN)16,17. Nella maggior parte delle applicazioni,l’imaging Ca 2 non raggiunge la stessa risoluzione temporale dell’elettrofisiologia. Pertanto, è probabile che un singolo evento Ca2 è analogo a una raffica di potenziali di azione neuronale. Questo può essere interpretato nel modo in cuil’imaging Ca 2 consente misure relativamente accurate dell’attività di scoppio anormale nelle cellule di pace ed è quindi appropriato per uno schermo ad alto contenuto della morte delle cellule eccitate mediate ca2.
Per realizzare e mantenerel’attività spontanea di Ca 2, è importante affrontare due punti chiave del protocollo. Il primo è la densità di placcatura delle cellule dopo la dissezione. Per i neuroni primari della macchina virtuale, studi precedenti hanno utilizzato circa 100.000cellule/cm 29,10. Abbiamo adattato il protocollo per placcare una densità di 200.000 cellule/cm2, che crea una gamma eterogenea di attività spontanea e aumenta il numero di neuroni VM dopaminergici presenti su ogni coperture. Poiché diversi neuroni del pacemaking hanno proprietà di cotturadistinte 16, la densità di placcatura deve essere personalizzata in base al tipo di cellula studiata e ottimizzata al fine di raggiungere livelli ideali di attività spontanea. Il secondo è il tempo di incubazione dopo l’infezione virale degli AAV. Come la densità di placcatura, questo dipenderà dal contesto specifico della domanda di ricerca e dal tipo di AAV in uso. Per l’AAV specifico utilizzato qui, 5 giorni di incubazione a seguito di infezione virale è ideale per raggiungere i livelli di espressione proteica desiderati, che consente cambiamenti dinamici nella fluorescenza GCaMP al fine di registrare l’attività di Ca2. Molti fattori determinano quanto rapidamente ed efficientemente un AAV esprimerà il suo carico, gran parte dei quali è al di fuori dell’ambito di questo metodo, ma brevemente, è importante considerare l’attività del promotore e la velocità con cui la proteina del carico matura e si piega.
Un altro vantaggio del metodo è che consente una notevole flessibilità nel formato, nei vettori di espressione, nell’uso di apparecchiature di imaging e nella gamma di domande scientifiche che possono essere affrontate. Inoltre, il metodo consente di indagare su una vasta gamma di domande specifiche che circondano l’eccitactotossicità mediata dal glutammato nella PD e altri modelli di disfunzione del sistema nervoso. Ad esempio, l’ecitotossicità mediata dal glutammato coinvolge più recettori e cascate di segnalazione5. Utilizzando il metodo, e come dimostrato con il blocco AMPAR, NBQX in Figura 1, è possibile sezionare componenti specifici della risposta del glutammato excitotossico a livello fisiologico e molecolare. In teoria, un approccio simile utilizzando inibitori dei sistemi di secondo messaggero potrebbe essere utilizzato per determinare il loro contributo all’eccitatossicità. Inoltre, gli AV utilizzati qui potrebbero essere adattati per esprimere i GECI con promotori specifici delle cellule o sensori optogenetici espressi da AAV che potrebbero essere utilizzati per misurare altri parametri come il rilascio di neurotrasmettitori.
Oltre alle dissezioni embrionali primarie e all’imaging confocale, gran parte del protocollo utilizza competenze di laboratorio di base che non richiedono una formazione specializzata. Pertanto, i limiti al modello includono la difficoltà della tecnica di dissezione embrionale, il periodo di tempo in cui le cellule devono essere colturate per raggiungere la maturità e l’accesso a un microscopio confocale, o a un apparato di imaging simile. I numerosi vantaggi e la flessibilità del metodo superano queste limitazioni, rendendo questo un modello ideale per studiare il ruolo di evitotossicità mediata dal glutammato nei disturbi del sistema nervoso. Infine, questo modello potrebbe essere uno strumento efficace per lo screening di nuovi composti per gli effetti anti-apoptotici e la loro capacità di preservare la salute dei neuroni DA.
The authors have nothing to disclose.
Supportato da sovvenzioni dell’American Parkinson Disease Association (APDA) e del NIH R01NS115809-01 alla RS. Ringraziamo il Texas A&M Institute for Genomic Medicine (TIGM) per aver fornito topi in gravidanza a tempo per generare colture dopaminergiche primarie.
10% Formalin/PBS | VWR | 100496-506 | |
10X NA 0.3 water-immersion objective | Olympus | UMPLFLN10XW | |
12 mm circular cover glass No. 1 | Phenix Research Products | MS20-121 | |
20X NA 0.85 oil-immersion objective | Olympus | UPLSAPO20XO | |
35 mm uncoated plastic cell culture dishes | VWR | 25382-348 | |
40X NA 0.3 water-immersion objective | Olympus | LUMPLFLN40XW | |
60X NA 1.35 oil-immersion objective | Olympus | UPLSAPO60XO | |
Ampicillin (sodium) | Gold Bio | A-301-25 | |
B-27 supplement | ThermoFisher | 17504044 | 50x stock |
Binolcular Microscope | Kent Scientific | KSCXTS-1121 | |
Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A7030 | |
Calcium Chloride (CaCl2), anhydrous | Sigma-Aldrich | 746495 | |
Chicken polyclonal anti-Tyrosine Hydroxylase | Abcam | ab76442 | |
Deoxyribonuclease I (DNase) | Sigma-Aldrich | DN25 | |
D-glucose, andydrous | Sigma-Aldrich | RDD016 | |
DMEM + GlutaMAX medium | ThermoFisher | 10569010 | 500 mL |
Equine serum | ThermoFisher | 26050088 | heat-inactivated |
Fiber Optic Illuminator, 100V | Kent Scientific | KSC5410 | |
Filter System, PES 22UM 250ML | VWR | 28199-764 | |
Fluoview 1000 confocal microscope | Olympus | ||
Fluoview 1200 confocal microscope | Olympus | ||
GlutaMAX supplement | ThermoFisher | 35050061 | |
Goat polyclonal anti-chicken Alexa Fluor 594 | Abcam | ab150176 | |
Goat polyclonal anti-rabbit Alexa Fluor 594 | Abcam | ab150077 | |
Hanks-balanced Salt Solution (HBSS) 1x | ThermoFisher | 14175095 | 500 mL |
HEPES | VWR | 101170-478 | |
HeraCell 150 CO2 incubator | Heraeus (ThermoFisher) | ||
ImageJ v1.52e | NIH | ||
IRIS-Fine Scissors (Round Type)-S/S Str/31*8mm/13cm | RWD | S12014-13 | |
Kanamycin monosulfate | Gold Bio | K-120-25 | |
Laminin | Sigma-Aldrich | L2020 | |
L-Ascorbic acid | Sigma-Aldrich | A7506 | |
L-glutamic acid | VWR | 97061-634 | |
Magnesium Chloride (MgCl2), andydrous | Sigma-Aldrich | M8266 | |
MPII Mini-Peristaltic Pump, 115/230 VAC, 50/60 Hz | Harvard Apparatus | 70-2027 | |
MULLER Micro Forceps-Str, 0.15mm Tips, 11cm | RWD | F11014-11 | |
NBQX | Hello Bio | HB0443 | |
Neurobasal medium | ThermoFisher | 21103049 | 500 mL |
Normal goat serum (NGS) | Abcam | ab7481 | |
Origin 2020 | OriginLab | ||
pAAV.Syn.GCaMP6f.WPRE.SV40 | Addgene | 100837-AAV1 | Titer: 1.00E+13 gc/ml |
Papain | Worthington Biomedical Corporation | LS003126 | |
Penicillin streptomycin | ThermoFisher | 15140122 | 10,000 U/mL |
Phosphate-buffered saline (PBS) 1x | ThermoFisher | 10010049 | 500 mL |
Poly-L-lysine | Sigma-Aldrich | P4832 | |
Poly-L-ornithine | Sigma-Aldrich | P4957 | |
Potassium Chloride (KCl), anhydrous | Sigma-Aldrich | 746436 | |
Pump Head Tubing Pieces For MPII | Harvard Apparatus | 55-4148 | |
Rabbit monoclonal anti-caspase-3 | Abcam | ab32351 | |
Sodium Chloride (NaCl), anhydrous | Sigma-Aldrich | 746398 | |
Sucrose | Sigma-Aldrich | S7903 | BioXtra, ≥99.5% (GC) |
Time-pregnant female C57BL/6 mice | Texas A&M Institue for Genomic Medicine | ||
Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | 500 mL |
Wide-bore blue pipette tips P1000 | VWR | 83007-380 |