여기에서 우리는 시험관 외 Ca에서 측정 하는 프로토콜을 제시2+ 중간 뇌 뉴런에서 플럭스와 1 차 마우스 중간 두뇌 문화를 사용 하 여 caspase-3에 그들의 다운 스트림 효과. 이 모델은 중뇌 뉴런에서 비정상적인 Ca2+ 활동과 관련된 병리학적 변화를 연구하고, 세포세포 항세포 특성에 대한 새로운 치료법을 선별하기 위해 사용될 수 있다.
파킨슨 병 (PD)은 도파민 (DA) 뉴런의 퇴행성으로 인한 치명적인 신경 퇴행성 질환입니다. 글루타민산 수용체의 비정상적인 활성화로 인한 과도한 Ca2+ 유입은 DA 절제독성을 초래하고 DA 뉴런 손실을 위한 중요한 메커니즘으로 확인되었습니다. 이 연구에서는, 우리는 ED14 마우스 배아의 마우스 복부 심뇌 mesencephalon (VM)에서 격리, 해리, 및 배양 중뇌 뉴런. 그런 다음 유전적으로 인코딩된 칼슘 지표를 발현하는 아데노 관련 바이러스(AAV)로 장기 1차 마우스 중뇌 배양을 감염시키고, GCaMP6f는 인간 뉴런 특이적 시냅신 프로모터, hSyn의 통제 하에 있다. 라이브 공초점 이미징을 사용하여, 우리는 배양 마우스 중뇌 뉴런이 AAV-hSyn-GCaMP6f에 의해 검출된 자발적인 Ca2+ 플럭스를 표시한다는 것을 보여줍니다. 중뇌 배양에 조미료의 목욕 응용 프로그램은 뉴런 내에서 세포 내 Ca2 + 비정상적인 고도를 일으키는 원인이되며, 이것은 면역 염색에 의해 입증 된 바와 같이, DA 뉴런에서 caspase-3 활성화를 동반한다. 1 차 마우스 DA 뉴런에서 글루타민산 매개 세포사멸을 식별하는 기술은 DA 뉴런 건강을 보존하는 약물의 높은 함량 선별에 대한 중요한 응용 프로그램이 있습니다.
파킨슨 병 (PD)은 알려진 치료법이없는 전 세계적으로 두 번째로 흔한 신경 퇴행성 질환입니다. 추정에 따르면 PD 보급은 계속 증가할 것이며 2030년까지미국에서만100만 개의 진단을 능가할 것으로 예상됩니다. 현재 PD를 퇴치하기 위해 사용할 수있는 몇 가지 효과적인 치료와 함께, 더 효과적인 치료를 개발하는 절박한 필요가있다. PD는 중뇌 도파민 (DA) 뉴런2의신속하고 점진적 인 손실을 특징으로한다. PD에서 신경 변성의 기초가 되는 기계장치는 제대로 이해되지 않습니다. 증거는 산화 스트레스 및 미토콘드리아 기능 장애 등과 같은 여러 메커니즘의 가능성이 수렴을 시사하며, 이는 세포 사멸 신호 캐스케이드 및 최종 세포 사멸 의 개시에 기여한다3.
이러한 수렴 메커니즘 중 하나, 글루타민산 매개 발췌 독성은 PD4를포함한 여러 신경 퇴행성 질환에 연루되었다. 글루타메이트 매개 흥분독성은 세포내 Ca2+ 농도 및 종말 개시의 과도한 증가를 통해 NMDA 수용체의 자극을 통해 주로 작동하도록 생각되지만, Ca2+투과성 AMPA 수용체도 발독 반응5,,6,,7에연루되어 있다. 따라서, PD 모델 내에서 글루타민산염 매개 세포사멸에 AMPA 수용체의 기여를 결정하는 것이 흥미로하다. 이는 AMPA 및 kainate 차단제인 NBQX를 사용하여 달성될 수 있으며, 이는 마이크로몰라 농도에서 AMPA 수용체8에대해 선택적이다. 글루타민산매개 엑시토토독성 및 세포사멸 신호 캐스케이드는 세포 사멸의 정도를 측정하는 이상적인 다운스트림 표적이며 치료 개입을 위한 잠재적인 표적이다. 따라서, 1차 복부 심폐(VM) 뉴런에서 글루타메이트 매개 변조 및 관련 다운스트림 신호 조절을 평가하기 위한 고함량 방법을 개발하는 것은 뉴런 건강을 보존하는 능력에 대한 새로운 치료 방법을 선별하는 데 유용할 것이다.
여기서, 우리는 인간 시냅신(hSyn) 프로모터와 AAV2/5를 사용하여 생리학적 및 분자 수준에서 측정할 수 있는 글루타민트 애플리케이션에 대응하여 마우스 VM 1차 뉴런의Ca2+ 활성을 측정하는 유전자 코딩된 칼슘 표시기(GECI), GCaMP6f를 발현하는 프로토콜을 개발했습니다. 이 고함량 스크리닝은 VM 뉴런의 건강을 보존하기 위해 Ca2+ 활동을 조절하는 제약 또는 치료법을 발견하기 위해 조정할 수 있습니다. 우리는이 기본 문화 모델은 VM 뉴런의 건강을 보존하고 PD의 진행을 완화하는 능력에 따라 새로운 PD 개입을 선별하는 효과적인 방법이라고 제안합니다.
우리는 뉴런에서 글루타민산 매개 세포석증의 고함량 분석을 위한 장기 1 차적인 1차 복부 심폐(VM) 세포 배양 시스템을 기술합니다. 연구는 PD 모델 의 맥락에서 엑시토 독성 메커니즘을 해명하기 위해 기본 중뇌 도파민 문화를사용하였다 11,,12. 이 연구에서는, 우리는 Ca2+ 활동을 측정하고 더 apoptotic 신호 캐스케이드4의개시와 같은 다운스트림 분자 변화와 이 활동을 연관시키기 위하여 유전으로 인코딩된 칼슘 표시기(GECIs)를 사용하여 조합접근을 채택합니다. 이 방법은 다른 유사한 세포 배양 시스템에 여러 가지 장점이 있습니다. 우리는 파킨슨 병의 맥락 내에서 흥분 독성에 특히 관심이 있기 때문에, 1 차적인 VM 세포 배양을 사용하는 것이 이상적입니다. TH 면역염색과 결합된 격자 표지또는 전동 XY 현미경 단계와 같은 다른 필드 재배치 기술을 사용하여, 우리는 복부 중뇌 뉴런에서 글루타민산 매개 세포 세포 세포의 특정 효과를 직접 연구할 수 있습니다. 또한, 3 주 세포 배양 모델은 뉴런이 성인 DA 뉴런9을반영하여 전체, 성숙한 분자 프로파일을 개발할 수 있게 합니다. 이전 방법은 주로 글루타민산 매개 흥분 독성13,,14에따른 분자 변화에 초점을 맞추고 있다. 이 모델은 뉴런 생리학의 급성 변화와 확인된 세포 유형의 다운스트림 분자 사건과 상관 관계를 맺는 능력이 독특합니다. 1 차 배양 모델의 한 가지 제한은 해부 기술이 전체 복부 중뇌를 캡처한다는 것입니다, DA와 GABAergic 뉴런뿐만 아니라 SNc와 VTA에서 뉴런을 포함. 증거는 지금 SNc의 DA 뉴런이 이웃 VTA15의DA 뉴런에 비해 칼슘과 최종 세포 사멸에 선택적 취약점이 있음을 시사한다. 불행히도, 배아 배양 배양에서 VTA 뉴런에서 SNc를 차별화하는 것은 배아 뇌에서 이러한 구조를 정의하는 몇 가지 해부학 적 랜드 마크와 어려운 입증했다.
우리는 기본 배양 기술이 이종 자발적인 Ca2+ 활동의 정량화를 허용한다는 것을 보여줍니다(도 1). 따라서, 이것은 중뇌의 페이스메이킹 도파민간 뉴런, 신코르티컬 뉴런, 및 수막핵(SCN)16,,17의GABAergic 뉴런과 같은 톤활성 세포를 연구하는 이상적인 세포 배양 시스템 모델이다. 대부분의 응용 프로그램에서 Ca2+ 이미징은 전기 생리학과 동일한 시간적 해결을 달성하지 못합니다. 따라서 단일 Ca2+ 이벤트는 신경 작용 잠재력의 파열과 유사할 수 있습니다. 이는 Ca2+ 이미징이 페이스메이킹 세포에서 비정상적인 파열 활성을 비교적 정확하게 측정할 수 있으며 따라서 Ca2+-매개엑시토독성 세포 사멸의 고함량 스크린에 적합하다는 것을 의미하기 위해 해석될 수 있다.
자발적인 Ca2+ 활동을 달성하고 유지 관리하려면 프로토콜의 두 가지 핵심 사항을 해결하는 것이 중요합니다. 첫 번째는 해부 다음 세포의 도금 밀도입니다. 1 차적인 VM 뉴런을 위해, 이전 연구 결과는 약 100,000 세포/cm29,,10을사용했습니다. 우리는 200,000 세포 /cm2의밀도를 플레이트 프로토콜을 조정하여 이종성 범위의 자발적 인 활성을 생성하고 각 커버 슬립에 존재하는 도파민 성 VM 뉴런의 수를 증가시킵니다. 다른 페이스 메이킹 뉴런은 뚜렷한 발사 특성을 가지고 있기 때문에16,도금 밀도는 연구되고 자발적 인 활동의 이상적인 수준을 달성하기 위해 최적화되는 세포 유형에 사용자 정의 할 필요가있다. 두 번째는 AAV의 바이러스 감염 에 따른 잠복기입니다. 도금 밀도처럼, 이것은 연구 질문의 특정 컨텍스트와 사용되는 AAV의 유형에 따라 달라집니다. 여기서 사용되는 특정 AAV의 경우, 바이러스 감염 에 따른 5일 간의 배양은 원하는 단백질 발현 수준을 달성하는 데 이상적이며, 이는 Ca2+ 활성을 기록하기 위해 GCaMP 형광의 동적 변화를 허용한다. 많은 요인이 AAV가화물을 얼마나 빠르고 효율적으로 표현할 것인지를 결정하며, 그 중 상당수는 이 방법의 범위를 벗어났지만, 간단히 말해서, 프로모터 활동과 화물 단백질이 성숙하고 접는 속도를 고려하는 것이 중요합니다.
이 방법의 또 다른 장점은 형식, 발현 벡터, 이미징 장비 사용 및 해결할 수 있는 과학적 질문의 범위에서 상당한 유연성을 허용한다는 것입니다. 또한, 이 방법은 PD의 글루타메이트 매개 흥분 독성및 신경계 기능 장애의 다른 모델을 둘러싸는 광범위한 특정 질문에 대한 문의를 가능하게 합니다. 예를 들어, 글루타민산 매개 흥분독성은 다중 수용체와 신호 캐스케이드5를포함한다. 상기 방법을 이용하여, AMPAR 차단제, NBQX를 도 1에서,생리학적 및 분자 수준에서 엑시토독성 글루타민반응의 특정 성분을 해부할 수 있다. 생각할 수 있는, 두 번째 메신저 시스템의 억제제를 사용 하 여 비슷한 접근 흥분 독성에 그들의 기여를 결정 하는 데 사용할 수 있습니다. 또한, 여기에 사용되는 AAV는 신경 전달 물질 방출과 같은 다른 매개 변수를 측정하는 데 사용할 수있는 세포 특정 프로모터 또는 AAV 발현 광유전학 센서로 GECI를 발현하도록 적응 될 수 있습니다.
1 차적인 배아 해부 및 공초점 화상 진찰을 제외하고, 프로토콜의 대부분은 특수 교육을 필요로 하지 않는 기본적인 실험실 기술을 이용합니다. 따라서, 모델에 대한 제한은 배아 해부 기술의 난이도, 세포가 성숙에 도달하기 위해 배양되어야 하는 시간의 길이, 및 공초점 현미경, 또는 유사한 이미징 장치에 대한 접근을 포함한다. 이 방법의 많은 이점과 유연성은 이러한 한계보다 더 중요하므로 신경계 장애에서 글루타메이트 매개 흥분 독성을 연구하기에 이상적인 모델입니다. 마지막으로,이 모델은 안티 세포 효과 와 DA 뉴런 건강을 보존 하는 그들의 능력에 대 한 새로운 화합물을 스크린 하는 효과적인 도구가 될 수 있습니다.
The authors have nothing to disclose.
미국 파킨슨 병 협회 (APDA)와 NIH R01NS15809-01RS의 보조금에 의해 지원됩니다. 텍사스 유전체 의학 연구소 (TIGM)는 1 차적인 도파민 문화를 생성하기 위하여 시간 조정된 임신 마우스를 제공한 것을 감사합니다.
10% Formalin/PBS | VWR | 100496-506 | |
10X NA 0.3 water-immersion objective | Olympus | UMPLFLN10XW | |
12 mm circular cover glass No. 1 | Phenix Research Products | MS20-121 | |
20X NA 0.85 oil-immersion objective | Olympus | UPLSAPO20XO | |
35 mm uncoated plastic cell culture dishes | VWR | 25382-348 | |
40X NA 0.3 water-immersion objective | Olympus | LUMPLFLN40XW | |
60X NA 1.35 oil-immersion objective | Olympus | UPLSAPO60XO | |
Ampicillin (sodium) | Gold Bio | A-301-25 | |
B-27 supplement | ThermoFisher | 17504044 | 50x stock |
Binolcular Microscope | Kent Scientific | KSCXTS-1121 | |
Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A7030 | |
Calcium Chloride (CaCl2), anhydrous | Sigma-Aldrich | 746495 | |
Chicken polyclonal anti-Tyrosine Hydroxylase | Abcam | ab76442 | |
Deoxyribonuclease I (DNase) | Sigma-Aldrich | DN25 | |
D-glucose, andydrous | Sigma-Aldrich | RDD016 | |
DMEM + GlutaMAX medium | ThermoFisher | 10569010 | 500 mL |
Equine serum | ThermoFisher | 26050088 | heat-inactivated |
Fiber Optic Illuminator, 100V | Kent Scientific | KSC5410 | |
Filter System, PES 22UM 250ML | VWR | 28199-764 | |
Fluoview 1000 confocal microscope | Olympus | ||
Fluoview 1200 confocal microscope | Olympus | ||
GlutaMAX supplement | ThermoFisher | 35050061 | |
Goat polyclonal anti-chicken Alexa Fluor 594 | Abcam | ab150176 | |
Goat polyclonal anti-rabbit Alexa Fluor 594 | Abcam | ab150077 | |
Hanks-balanced Salt Solution (HBSS) 1x | ThermoFisher | 14175095 | 500 mL |
HEPES | VWR | 101170-478 | |
HeraCell 150 CO2 incubator | Heraeus (ThermoFisher) | ||
ImageJ v1.52e | NIH | ||
IRIS-Fine Scissors (Round Type)-S/S Str/31*8mm/13cm | RWD | S12014-13 | |
Kanamycin monosulfate | Gold Bio | K-120-25 | |
Laminin | Sigma-Aldrich | L2020 | |
L-Ascorbic acid | Sigma-Aldrich | A7506 | |
L-glutamic acid | VWR | 97061-634 | |
Magnesium Chloride (MgCl2), andydrous | Sigma-Aldrich | M8266 | |
MPII Mini-Peristaltic Pump, 115/230 VAC, 50/60 Hz | Harvard Apparatus | 70-2027 | |
MULLER Micro Forceps-Str, 0.15mm Tips, 11cm | RWD | F11014-11 | |
NBQX | Hello Bio | HB0443 | |
Neurobasal medium | ThermoFisher | 21103049 | 500 mL |
Normal goat serum (NGS) | Abcam | ab7481 | |
Origin 2020 | OriginLab | ||
pAAV.Syn.GCaMP6f.WPRE.SV40 | Addgene | 100837-AAV1 | Titer: 1.00E+13 gc/ml |
Papain | Worthington Biomedical Corporation | LS003126 | |
Penicillin streptomycin | ThermoFisher | 15140122 | 10,000 U/mL |
Phosphate-buffered saline (PBS) 1x | ThermoFisher | 10010049 | 500 mL |
Poly-L-lysine | Sigma-Aldrich | P4832 | |
Poly-L-ornithine | Sigma-Aldrich | P4957 | |
Potassium Chloride (KCl), anhydrous | Sigma-Aldrich | 746436 | |
Pump Head Tubing Pieces For MPII | Harvard Apparatus | 55-4148 | |
Rabbit monoclonal anti-caspase-3 | Abcam | ab32351 | |
Sodium Chloride (NaCl), anhydrous | Sigma-Aldrich | 746398 | |
Sucrose | Sigma-Aldrich | S7903 | BioXtra, ≥99.5% (GC) |
Time-pregnant female C57BL/6 mice | Texas A&M Institue for Genomic Medicine | ||
Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | 500 mL |
Wide-bore blue pipette tips P1000 | VWR | 83007-380 |