هنا نقدم بروتوكول لقياس في المختبر Ca2 + التدفقات في الخلايا العصبية في منتصف البران وآثارها على مجرى النهر caspase -3 باستخدام الثقافات الأولية منتصف الماوس. يمكن استخدام هذا النموذج لدراسة التغيرات الفيزيائية الباثولوجية المتعلقة بنشاط Ca2+ غير طبيعي في الخلايا العصبية في منتصف البران ، ولفحص العلاجات الجديدة للخصائص المضادة للاختصاص.
مرض باركنسون (PD) هو اضطراب عصبي مدمر ناجم عن انحطاط الخلايا العصبية الدوبامينية (DA). الإفراط في Ca2+ تدفق بسبب تنشيط غير طبيعي من نتائج مستقبلات الغلوتامات في دا excitotoxicity وقد تم تحديدها كآلية هامة لفقدان الخلايا العصبية DA. في هذه الدراسة، نقوم بعزل الخلايا العصبية في منتصف القرنية، وننفصل عنها، ونتفثها عن التنفيس البطني للماوس (VM) من أجنة الماوس ED14. ثم نصيب الثقافات منتصف الماوس الأولية على المدى الطويل مع فيروس مرتبط أدينو (AAV) التعبير عن مؤشر الكالسيوم المشفرة وراثيا، GCaMP6f تحت سيطرة المروج العصبية البشرية محددة، hSyn. باستخدام التصوير confocal الحية، ونحن نظهر أن الخلايا العصبية منتصف منتصف الماوس مثقف عرض عفوية Ca2+ التدفقات التي تم الكشف عنها من قبل AAV-hSyn-GCaMP6f. حمام تطبيق الغلوتامات لثقافات منتصف البراري يسبب ارتفاعات غير طبيعية في داخل الخلايا كاليفورنيا2 + داخل الخلايا العصبية ويرافق هذا من قبل كاسباس-3 التنشيط في الخلايا العصبية DA, كما يتضح من الكبت المناعي. تقنيات لتحديد المبرمج الغلوتامية بوساطة في الخلايا العصبية DA الماوس الأولية لها تطبيقات هامة لفحص المحتوى العالي من الأدوية التي تحافظ على صحة الخلايا العصبية DA.
مرض باركنسون (PD) هو ثاني أكثر الاضطرابات العصبية شيوعا في جميع أنحاء العالم، مع عدم وجود علاج معروف. وتشير التقديرات إلى أن انتشار داء الإيدز سوف يستمر في الزيادة ومن المتوقع أن يتجاوز مليون تشخيص بحلول عام 2030 في الولايات المتحدة وحدها1. مع عدد قليل من العلاجات الفعالة المتاحة حاليا لمكافحة PD، وهناك حاجة ملحة لتطوير علاجات أكثر فعالية. يتميز PD بالفقدان السريع والتقدمي للدوبامين في منتصف الفقر (DA) الخلايا العصبية2. الآليات التي تكمن وراء التنكس العصبي في PD غير مفهومة بشكل جيد. وتشير الأدلة إلى احتمال وجود تقارب بين آليات متعددة، مثل الإجهاد التأسدي والخلل الوظيفي الميتوكوندريا، وما إلى ذلك التي تسهم في بدء الشلالات الإشارات المبرمجة وموت الخلايا في نهاية المطاف3.
واحدة من هذه الآلية متقاربة، وقد تورط الغلوتامات بوساطة exciticicity في أمراض الأعصاب متعددة، بما في ذلك PD4. في حين يعتقد أن السمية الغلوتامية بوساطة الغلوتامات تعمل بشكل رئيسي من خلال تحفيز مستقبلات NMDA عبر زيادة مفرطة في تركيز Ca2+ داخل الخلايا وبدء المبرمج في نهاية المطاف ، Ca2 +– مستقبلات AMPA – نفاذية تورطت أيضًا في استجابة السامة5،6،7. ولذلك، فمن المهم تحديد مساهمة مستقبلات AMPA إلى المبرمج الغلوتامي بوساطة داخل نموذج PD. ويمكن تحقيق ذلك باستخدام NBQX، و أمبا وحاصرة القيات، والتي في تركيزات micromolar انتقائي لمستقبلات AMPA8. إن السمية الغلوتامية والإشارات التعاقبية اللوائية هي هدف مثالي في المصب لقياس مدى موت الخلايا، وهدف محتمل للتدخل العلاجي. لذلك، فإن تطوير طريقة عالية المحتوى لتقييم تعديل الغلوتامات بوساطة نشاط الكالسيوم وما يرتبط به من إشارات المصب في الخلايا العصبية المتوسطة البطنية الأولية (VM) سيكون ذا قيمة لفحص طرق العلاج الجديدة على قدرتها على الحفاظ على صحة الخلايا العصبية.
هنا، وضعنا بروتوكولاً نعبر فيه عن مؤشر الكالسيوم المشفر وراثياً (GECI)، GCaMP6f، باستخدام AAV2/5 مع نقطة الاشتباك العصبي البشرية (hSyn) لتعزيز قياس نشاط Ca2+ من الخلايا العصبية الأولية للماوس VM استجابة لتطبيق الغلوتامات الذي يمكن قياسه على المستوى الفسيولوجي والجزيئي. يمكن تكييف هذا الفحص عالي المحتوى لاكتشاف المستحضرات الصيدلانية أو العلاجات التي تعدل نشاط Ca2+ للحفاظ على صحة الخلايا العصبية VM. نقترح أن هذا النموذج الثقافة الأولية هو وسيلة فعالة لفحص تدخلات PD جديدة، على أساس قدرتها على الحفاظ على صحة الخلايا العصبية VM والتخفيف من تطور PD.
نحن نصف على المدى الطويل الأولية فيتسترال mesencephalic (VM) خلية نظام لثقافة لتحليل عالية المحتوى من المبرمج الغلوتامية بوساطة في الخلايا العصبية. وقد استخدمت الدراسات الثقافات الدوبامين منتصف الابتدائي لتوضيح آليات excitotoxic في سياق نماذج PD11,12. في هذه الدراسة، ونحن نستخدم نهج الجمع باستخدام مؤشرات الكالسيوم المشفرة وراثيا (GECIs) لقياس النشاط كاليفورنيا2 + وربط هذا النشاط مع التغيرات الجزيئية المصب، مثل بدء الشلالات إشارات المبرمج4. الأسلوب له مزايا متعددة لأنظمة أخرى مشابهة لثقافة الخلية. كما لدينا اهتمام خاص في excitotoxicity في سياق مرض باركنسون، وذلك باستخدام الثقافات الخلية VM الأولية مثالية. باستخدام تقنيات نقل الحقل المختلفة، مثل الأغطية الشبكية أو مرحلة مجهر XY الآلية جنبا إلى جنب مع TH مناعة، يمكننا دراسة مباشرة نوع الخلية آثار محددة من المبرمج الغلوتام بوساطة في الخلايا العصبية منتصف البطن. بالإضافة إلى ذلك, نموذج ثقافة الخلية 3 أسابيع يسمح للخلايا العصبية لتطوير كامل, ناضجة ملفها الجزيئي, تعكس الخلايا العصبية دا الكبار9. وقد ركزت الأساليب السابقة أساسا على التغيرات الجزيئية بعد الغلوتامات بوساطة excitotoxicity13,14. النموذج هو فريد من نوعه في قدرته على ربط التغيرات الحادة في فسيولوجيا الخلايا العصبية مع الأحداث الجزيئية المصب في أنواع الخلايا المحددة. أحد القيود على نموذج الثقافة الأولية هو أن تقنية التشريح تلتقط منتصف البطن بالكامل ، بما في ذلك DA والخلايا العصبية GABAergic وكذلك الخلايا العصبية من SNc و VTA. تشير الأدلة الآن إلى أن الخلايا العصبية DA من SNc لديها ضعف انتقائي للكالسيوم وموت الخلايا في نهاية المطاف مقارنة بالخلايا العصبية DA من VTAالمجاورة 15. لسوء الحظ، التمييز بين SNC والخلايا العصبية VTA في الثقافات الجنينية قد ثبت صعوبة مع عدد قليل من المعالم التشريحية لتحديد هذه الهياكل في الدماغ الجنيني.
ونحن نثبت أن تقنية الثقافة الأولية تسمح لك بالتكون الكمي لـ Ca2+ النشاط العفوي(الشكل 1). ولذلك، وهذا هو نموذج نظام ثقافة الخلية مثالية لدراسة الخلايا النشطة منشط، مثل الخلايا العصبية الدوبامين في ضربات القلب من منتصف القرن، الخلايا العصبية القشرية الجديدة، والخلايا العصبية GABAergic من نواة فوق شيازمية (SCN)16،17. في معظم التطبيقات، لا يحقق التصوير Ca2+ نفس الدقة الزمنية مثل علم الفيزيولوجيا الكهربائية. ولذلك، فمن المرجح أن واحد كاليفورنيا2 + الحدث مماثل لموجة من إمكانات العمل العصبي. ويمكن تفسير هذا على أن يعني أن كا2 + التصوير يسمح لمقاييس دقيقة نسبيا من نشاط الانفجار غير طبيعي في خلايا منظم ضربات القلب ، وبالتالي هو مناسب لشاشة عالية المحتوى من كاليفورنيا2 + –بوساطة موت الخلايا excitotoxic.
لتحقيق وصيانة النشاط التلقائي Ca2+ ، من المهم معالجة نقطتين رئيسيتين في البروتوكول. الأول هو كثافة الطلاء من الخلايا التالية تشريح. بالنسبة للخلايا العصبية VM الأولية، استخدمت الدراسات السابقة حوالي 100،000 الخلايا/سم29،10. لقد تكيفنا مع البروتوكول إلى لوحة كثافة 200،000 الخلايا / سم2، مما يخلق مجموعة heterogenous من النشاط العفوي ويزيد من عدد الخلايا العصبية VM الدوبامين الموجودة على كل coverlip. منذ مختلف الخلايا العصبية تنظيم ضربات القلب لها خصائص اطلاق النار متميزة16، وكثافة الطلاء يحتاج إلى تخصيص لنوع الخلية التي تدرس وتحسينها من أجل تحقيق مستويات مثالية من النشاط العفوي. والثاني هو وقت الحضانة بعد العدوى الفيروسية من AAVs. مثل كثافة الطلاء ، وهذا سوف يكون رهنا السياق المحدد للمسألة البحث ونوع AAV المستخدمة. لAV محددة المستخدمة هنا، 5 أيام من الحضانة بعد العدوى الفيروسية مثالية لتحقيق مستويات التعبير البروتين المطلوب، والذي يسمح للتغيرات الديناميكية في الفلوريس GCaMP من أجل تسجيل النشاط كاليفورنيا2+ . العديد من العوامل تحدد مدى سرعة وكفاءة AAV سوف تعبر عن حمولتها ، والكثير منها خارج نطاق هذه الطريقة ، ولكن بإيجاز ، من المهم النظر في نشاط المروج والمعدل الذي ينضج بروتين الشحن ويطوى.
ومن المزايا الأخرى لهذه الطريقة أنها تسمح بمرونة كبيرة في الشكل، ومتجهات التعبير، واستخدام معدات التصوير، ومجموعة الأسئلة العلمية التي يمكن معالجتها. بالإضافة إلى ذلك، تمكن هذه الطريقة من التحقيق في مجموعة واسعة من الأسئلة المحددة التي تحيط بالإثارة التي تتوسطها الغلوتامات في PD، ونماذج أخرى من الخلل في الجهاز العصبي. على سبيل المثال، الغلوتامات بوساطة excitotoxicity ينطوي على مستقبلات متعددة وشلالات إشارة5. باستخدام الأسلوب، وكما هو موضح مع مانع AMPAR، NBQX في الشكل 1، فمن الممكن تشريح مكونات محددة من استجابة الغلوتامات excitotox على المستوى الفسيولوجية والجزيئية. ويمكن تصور أن نهجا مماثلا يستخدم مثبطات نظم الرسل الثانية يمكن استخدامه لتحديد مساهمتها في السمية. بالإضافة إلى ذلك، يمكن تكييف AAVs المستخدمة هنا للتعبير عن GECIs مع المروجين الخلية الخاصة أو أجهزة الاستشعار optogenetic التي أعرب عنها AAV التي يمكن استخدامها لقياس المعلمات الأخرى مثل إطلاق الناقل العصبي.
وبصرف النظر عن التشريح الجنيني الأولي والتصوير confocal، يستخدم الكثير من البروتوكول المهارات المختبرية الأساسية التي لا تتطلب تدريبا متخصصا. لذلك ، فإن القيود على النموذج تشمل صعوبة تقنية التشريح الجنينية ، وطول الوقت الذي يجب أن تكون الخلايا مثقفة للوصول إلى مرحلة النضج ، والوصول إلى مجهر confocal ، أو جهاز تصوير مماثل. الفوائد والمرونة العديدة من الأسلوب تفوق هذه القيود، مما يجعل هذا النموذج المثالي لدراسة دور الغلوتامات بوساطة excitotoxicity في اضطرابات الجهاز العصبي. وأخيرا, هذا النموذج يمكن أن يكون أداة فعالة لفحص المركبات الجديدة للآثار المضادة لبروتيكة والقدرة على الحفاظ على صحة الخلايا العصبية DA.
The authors have nothing to disclose.
بدعم من المنح المقدمة من جمعية مرض باركنسون الأمريكية (APDA) وNIH R01NS115809-01 إلى RS. نشكر معهد تكساس A&M للطب الجينومي (TIGM) على توفير الفئران الحامل في الوقت المناسب لتوليد الثقافات الدوبامينية الأولية.
10% Formalin/PBS | VWR | 100496-506 | |
10X NA 0.3 water-immersion objective | Olympus | UMPLFLN10XW | |
12 mm circular cover glass No. 1 | Phenix Research Products | MS20-121 | |
20X NA 0.85 oil-immersion objective | Olympus | UPLSAPO20XO | |
35 mm uncoated plastic cell culture dishes | VWR | 25382-348 | |
40X NA 0.3 water-immersion objective | Olympus | LUMPLFLN40XW | |
60X NA 1.35 oil-immersion objective | Olympus | UPLSAPO60XO | |
Ampicillin (sodium) | Gold Bio | A-301-25 | |
B-27 supplement | ThermoFisher | 17504044 | 50x stock |
Binolcular Microscope | Kent Scientific | KSCXTS-1121 | |
Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A7030 | |
Calcium Chloride (CaCl2), anhydrous | Sigma-Aldrich | 746495 | |
Chicken polyclonal anti-Tyrosine Hydroxylase | Abcam | ab76442 | |
Deoxyribonuclease I (DNase) | Sigma-Aldrich | DN25 | |
D-glucose, andydrous | Sigma-Aldrich | RDD016 | |
DMEM + GlutaMAX medium | ThermoFisher | 10569010 | 500 mL |
Equine serum | ThermoFisher | 26050088 | heat-inactivated |
Fiber Optic Illuminator, 100V | Kent Scientific | KSC5410 | |
Filter System, PES 22UM 250ML | VWR | 28199-764 | |
Fluoview 1000 confocal microscope | Olympus | ||
Fluoview 1200 confocal microscope | Olympus | ||
GlutaMAX supplement | ThermoFisher | 35050061 | |
Goat polyclonal anti-chicken Alexa Fluor 594 | Abcam | ab150176 | |
Goat polyclonal anti-rabbit Alexa Fluor 594 | Abcam | ab150077 | |
Hanks-balanced Salt Solution (HBSS) 1x | ThermoFisher | 14175095 | 500 mL |
HEPES | VWR | 101170-478 | |
HeraCell 150 CO2 incubator | Heraeus (ThermoFisher) | ||
ImageJ v1.52e | NIH | ||
IRIS-Fine Scissors (Round Type)-S/S Str/31*8mm/13cm | RWD | S12014-13 | |
Kanamycin monosulfate | Gold Bio | K-120-25 | |
Laminin | Sigma-Aldrich | L2020 | |
L-Ascorbic acid | Sigma-Aldrich | A7506 | |
L-glutamic acid | VWR | 97061-634 | |
Magnesium Chloride (MgCl2), andydrous | Sigma-Aldrich | M8266 | |
MPII Mini-Peristaltic Pump, 115/230 VAC, 50/60 Hz | Harvard Apparatus | 70-2027 | |
MULLER Micro Forceps-Str, 0.15mm Tips, 11cm | RWD | F11014-11 | |
NBQX | Hello Bio | HB0443 | |
Neurobasal medium | ThermoFisher | 21103049 | 500 mL |
Normal goat serum (NGS) | Abcam | ab7481 | |
Origin 2020 | OriginLab | ||
pAAV.Syn.GCaMP6f.WPRE.SV40 | Addgene | 100837-AAV1 | Titer: 1.00E+13 gc/ml |
Papain | Worthington Biomedical Corporation | LS003126 | |
Penicillin streptomycin | ThermoFisher | 15140122 | 10,000 U/mL |
Phosphate-buffered saline (PBS) 1x | ThermoFisher | 10010049 | 500 mL |
Poly-L-lysine | Sigma-Aldrich | P4832 | |
Poly-L-ornithine | Sigma-Aldrich | P4957 | |
Potassium Chloride (KCl), anhydrous | Sigma-Aldrich | 746436 | |
Pump Head Tubing Pieces For MPII | Harvard Apparatus | 55-4148 | |
Rabbit monoclonal anti-caspase-3 | Abcam | ab32351 | |
Sodium Chloride (NaCl), anhydrous | Sigma-Aldrich | 746398 | |
Sucrose | Sigma-Aldrich | S7903 | BioXtra, ≥99.5% (GC) |
Time-pregnant female C57BL/6 mice | Texas A&M Institue for Genomic Medicine | ||
Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | 500 mL |
Wide-bore blue pipette tips P1000 | VWR | 83007-380 |