ここでは、中脳ニューロンのin vitro Ca2+ フラックスを測定するプロトコルと、プライマリマウス中脳培養を用いたカスパーゼ-3に対するその下流の影響を提示する。このモデルは、中脳ニューロンにおける異常なCa2+ 活性に関連する病態生理学的変化を研究し、抗アポトーシス特性の新しい治療法をスクリーニングするために使用することができる。
パーキンソン病(PD)は、ドーパミン作動性(DA)ニューロンの変性によって引き起こされる壊滅的な神経変性疾患である。グルタミン酸受容体の異常な活性化による過剰なCa2+ 流入は、DA興奮毒性をもたらし、DAニューロン喪失の重要なメカニズムとして同定されている。本研究では、ED14マウス胚のマウス腹側中頭症(VM)から中脳ニューロンを単離、解離、培養する。その後、ヒトニューロン特異的シナプシンプロモーターhSynの制御下で、遺伝的にコードされたカルシウム指標であるGCaMP6fを発現するアデノ関連ウイルス(AAV)を用いて、長期の一次マウス中脳培養物に感染する。ライブ共焦点イメージングを用いて、培養マウス中脳ニューロンがAAV-hSyn-GCaMP6fによって検出された自発的なCa2+ フラックスを表示することを示す。グルタミン酸を中脳培養に浴用に適用すると、ニューロン内の細胞内Ca2+ の異常な上昇を引き起こし、これは免疫染色によって示されるように、DAニューロンにおけるカスパーゼ3活性化を伴う。一次マウスDAニューロンにおけるグルタミン酸媒介アポトーシスを同定する技術は、DAニューロンの健康を維持する薬物の高含有スクリーニングに重要な用途を有する。
パーキンソン病(PD)は、世界的に2番目に一般的な神経変性疾患であり、治療法は知られていない。推定によると、PDの有病率は増加し続け、米国だけで2030年までに100万件を超えると予測されている。PDと戦うために現在利用可能な効果的な治療法はほとんどないので、より効果的な治療法を開発する必要があります。PDは、中脳ドーパミン(DA)ニューロン2の急速かつ進行性の損失によって特徴付けられる。PDの神経変性の根本となるメカニズムは十分に理解されていない。証拠は、アポトーシスシグナル伝達カスケードおよび最終的な細胞死の開始に寄与する酸化ストレスやミトコンドリア機能不全などの複数のメカニズムの収束の可能性を示唆している3。
このような収束機構の1つは、グルタミン酸媒介性興奮毒性がPD4を含む複数の神経変性疾患に関与している。グルタミン酸媒介性興奮毒性は、主に細胞内Ca2+濃度の過剰増加および最終的なアポトーシスの開始を介したNMDA受容体の刺激によって働くことと考えられているが、Ca2+-透過性AMPA受容体もまた、興奮性反応55、6、76,7に関与している。したがって、PDモデル内のグルタミン酸媒介アポトーシスに対するAMPA受容体の寄与を決定することが目的である。これは、NBQX、AMPAおよびカイネートブロッカーを用いて達成することができ、これはマイクロモル濃度でAMPA受容体8に対して選択的である。グルタミン酸媒介性興奮性およびアポトーシスシグナル伝達カスケードは、細胞死の程度を測定する理想的な下流標的であり、治療介入の潜在的な標的である。したがって、グルタミン酸媒介性カルシウム活性の調節および第一次腹側中脳症(VM)ニューロンにおける関連する下流シグナル伝達を評価するための高含有法を開発することは、ニューロンの健康を維持する能力に関する新しい治療法をスクリーニングする上で有益であろう。
ここでは、遺伝的にコード化されたカルシウム指標(GECI)、GCaMP6fを、AAV2/5とヒトシナプシン(hSyn)プロモートを用いて、生理学的および分子レベルで測定できるグルタミン酸アプリケーションに応答してマウスVM一次ニューロンのCa2+ 活性を測定するプロトコルを開発しました。この高含有スクリーニングは、VMニューロンの健康を維持するためにCa2+ 活性を調節する医薬品または治療法を発見するために適応することができる。我々は、この主要な培養モデルが、VMニューロンの健康を維持し、PDの進行を緩和する能力に基づいて、新しいPD介入をスクリーニングする効果的な方法であることを提案する。
ニューロンにおけるグルタミン酸媒介アポトーシスの高含有解析のための長期一次腹側中脳症(VM)細胞培養システムについて述べた。研究は、PDモデル11、12,の文脈で興奮性メカニズムを解明するために主要な中脳ドーパミン作動性培養を採用している。本研究では、遺伝的にコード化されたカルシウム指標(GECI)を用いた組み合わせアプローチを用いてCa2+活性を測定し、さらにこの活性をアポトーシスシグナル伝達カスケードの開始などの下流分子変化と関連付ける。この方法は、他の類似した細胞培養系に対して複数の利点を有する。パーキンソン病の文脈における興奮毒性に特に関心を持っているため、一次VM細胞培養を使用することが理想的である。グリッド付きカバースリップやTH免疫染色と組み合わせた電動XY顕微鏡ステージなど、異なるフィールド再配置技術を用いることで、腹側中脳ニューロンにおけるグルタミン酸媒介アポトーシスの細胞型特異的効果を直接研究することができます。さらに、3週間の細胞培養モデルは、ニューロンが成人DAニューロン9を反映して、完全で成熟した分子プロファイルを開発することを可能にする。以前の方法は、主にグルタミン酸媒介性興奮毒性13,14,14に続く分子変化に焦点を当ててきた。このモデルは、神経生理学の急性変化と同定された細胞タイプの下流の分子事象を関連付ける能力においてユニークである。一次培養モデルの1つの制限は、解剖技術が、DAおよびGABAergicニューロンならびにSNcおよびVTAのニューロンを含む腹側中脳全体を捕捉することです。SNcのDAニューロンは、隣接するVTA15のDAニューロンと比較して、カルシウムおよび最終的な細胞死に対する選択的脆弱性を有することを示唆する証拠がある。残念ながら、胚培養中のVTAニューロンからSNcを分化することは、胚性脳内でこれらの構造を定義する解剖学的ランドマークがほとんどないことが証明されています。
我々は、一次培養技術が異種自発的なCa2+活性の定量化を可能にすることを実証する(図1)。したがって、これは、中脳のペース形成ドーパミン作動性ニューロン、新皮質ニューロン、および、二重化核(SCN)16,17のGABAergicニューロンなどの、細胞間でのペース形成などの細胞を調べるための17理想的な細胞培養系モデルである。ほとんどのアプリケーションでは、Ca2+イメージングは電気生理学と同じ時間的分解能を達成しません。したがって、単一のCa2+イベントは、ニューロン作用電位のバーストに類似している可能性が高い。これは、Ca2+イメージングがペースメイキング細胞における異常な破裂活性の比較的正確な尺度を可能にし、したがってCa2+-媒介した興奮性細胞死の高い含有量スクリーンに適していることを意味すると解釈することができる。
自発的なCa2+ 活性を達成し維持するためには、プロトコルの2つの重要なポイントに対処することが重要です。第1は、解剖後の細胞のめっき密度である。プライマリ VM ニューロンの場合、これまでの研究では、約 100,000 個のセル/cm29,10を使用しています。我々は、自発的な活動の異種の範囲を作成し、各カバースリップに存在するドーパミン作動性VMニューロンの数を増加させる200,000細胞/cm2の密度をプレートするプロトコルを適応させました。異なるペースメイキングニューロンは、異なる発火特性16を有するので、メッキ密度は、自発的な活動の理想的なレベルを達成するために研究され、最適化されている細胞の種類に合わせてカスタマイズする必要があります。第二は、AAVのウイルス感染後の潜伏時間である。めっき密度と同様に、これは使用されているAAVの研究問題とタイプの特定の文脈に依存する。ここで用いられる特定のAAVについては、ウイルス感染後の5日間のインキュベーションが所望のタンパク質発現レベルを達成するのに理想的であり、これはCa2+ 活性を記録するためにGCaMP蛍光の動的変化を可能にする。多くの要因は、AAVがその貨物をどれだけ迅速かつ効率的に表現するかを決定しますが、その多くは、この方法の範囲外ですが、簡単に言えば、プロモーター活性と貨物タンパク質が成熟し、折り畳む速度を考慮することが重要です。
この方法のもう1つの利点は、フォーマット、発現ベクター、イメージング機器の使用、および対処可能な科学的な質問の範囲においてかなりの柔軟性を可能にすることです。さらに、この方法は、PDにおけるグルタミン酸媒介性興奮毒性、および神経系機能不全の他のモデルを取り巻く広範な特定の質問に関する調査を可能にする。例えば、グルタミン酸媒介性興奮毒性は、複数の受容体およびシグナル伝達カスケード5を伴う。この方法を用いることによって、 図1のAMPARブロッカー、NBQXと共に示したように、興奮性グルタミン酸反応の特定の成分を生理学的および分子レベルで解剖することができる。おそらく、第二のメッセンジャーシステムの阻害剤を使用して同様のアプローチを使用して、興奮毒性へのそれらの寄与を決定することができる。さらに、ここで使用されるAAVは、細胞特異的プロモーターまたは神経伝達物質放出などの他のパラメータを測定するために使用できるAAV発現光遺伝学的センサーを備えたGECIを発現するように適応することができる。
一次胚分節と共焦点イメージングとは別に、プロトコルの多くは専門的な訓練を必要としない基本的な実験室のスキルを使用しています。したがって、モデルの限界は、胚解離技術の難しさ、成熟に達するまで細胞を培養しなければならない時間の長さ、および共焦点顕微鏡、または同様の画像化装置へのアクセスを含む。この方法の多くの利点と柔軟性がこれらの制限を上回り、神経系障害におけるグルタミン酸媒介性興奮毒性の役割を研究するための理想的なモデルとなる。最後に、このモデルは、抗アポトーシス効果とDAニューロンの健康を維持する能力のための新しい化合物をスクリーニングするための効果的なツールとなり得る。
The authors have nothing to disclose.
米国パーキンソン病協会(APDA)とNIH R01NS115809-01からRSへの助成金によってサポートされています。テキサスA&Mゲノム医学研究所(TIGM)は、原発性ドーパミン作動性培養を生み出すタイミングの高い妊娠中のマウスを提供してくれたことに感謝します。
10% Formalin/PBS | VWR | 100496-506 | |
10X NA 0.3 water-immersion objective | Olympus | UMPLFLN10XW | |
12 mm circular cover glass No. 1 | Phenix Research Products | MS20-121 | |
20X NA 0.85 oil-immersion objective | Olympus | UPLSAPO20XO | |
35 mm uncoated plastic cell culture dishes | VWR | 25382-348 | |
40X NA 0.3 water-immersion objective | Olympus | LUMPLFLN40XW | |
60X NA 1.35 oil-immersion objective | Olympus | UPLSAPO60XO | |
Ampicillin (sodium) | Gold Bio | A-301-25 | |
B-27 supplement | ThermoFisher | 17504044 | 50x stock |
Binolcular Microscope | Kent Scientific | KSCXTS-1121 | |
Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A7030 | |
Calcium Chloride (CaCl2), anhydrous | Sigma-Aldrich | 746495 | |
Chicken polyclonal anti-Tyrosine Hydroxylase | Abcam | ab76442 | |
Deoxyribonuclease I (DNase) | Sigma-Aldrich | DN25 | |
D-glucose, andydrous | Sigma-Aldrich | RDD016 | |
DMEM + GlutaMAX medium | ThermoFisher | 10569010 | 500 mL |
Equine serum | ThermoFisher | 26050088 | heat-inactivated |
Fiber Optic Illuminator, 100V | Kent Scientific | KSC5410 | |
Filter System, PES 22UM 250ML | VWR | 28199-764 | |
Fluoview 1000 confocal microscope | Olympus | ||
Fluoview 1200 confocal microscope | Olympus | ||
GlutaMAX supplement | ThermoFisher | 35050061 | |
Goat polyclonal anti-chicken Alexa Fluor 594 | Abcam | ab150176 | |
Goat polyclonal anti-rabbit Alexa Fluor 594 | Abcam | ab150077 | |
Hanks-balanced Salt Solution (HBSS) 1x | ThermoFisher | 14175095 | 500 mL |
HEPES | VWR | 101170-478 | |
HeraCell 150 CO2 incubator | Heraeus (ThermoFisher) | ||
ImageJ v1.52e | NIH | ||
IRIS-Fine Scissors (Round Type)-S/S Str/31*8mm/13cm | RWD | S12014-13 | |
Kanamycin monosulfate | Gold Bio | K-120-25 | |
Laminin | Sigma-Aldrich | L2020 | |
L-Ascorbic acid | Sigma-Aldrich | A7506 | |
L-glutamic acid | VWR | 97061-634 | |
Magnesium Chloride (MgCl2), andydrous | Sigma-Aldrich | M8266 | |
MPII Mini-Peristaltic Pump, 115/230 VAC, 50/60 Hz | Harvard Apparatus | 70-2027 | |
MULLER Micro Forceps-Str, 0.15mm Tips, 11cm | RWD | F11014-11 | |
NBQX | Hello Bio | HB0443 | |
Neurobasal medium | ThermoFisher | 21103049 | 500 mL |
Normal goat serum (NGS) | Abcam | ab7481 | |
Origin 2020 | OriginLab | ||
pAAV.Syn.GCaMP6f.WPRE.SV40 | Addgene | 100837-AAV1 | Titer: 1.00E+13 gc/ml |
Papain | Worthington Biomedical Corporation | LS003126 | |
Penicillin streptomycin | ThermoFisher | 15140122 | 10,000 U/mL |
Phosphate-buffered saline (PBS) 1x | ThermoFisher | 10010049 | 500 mL |
Poly-L-lysine | Sigma-Aldrich | P4832 | |
Poly-L-ornithine | Sigma-Aldrich | P4957 | |
Potassium Chloride (KCl), anhydrous | Sigma-Aldrich | 746436 | |
Pump Head Tubing Pieces For MPII | Harvard Apparatus | 55-4148 | |
Rabbit monoclonal anti-caspase-3 | Abcam | ab32351 | |
Sodium Chloride (NaCl), anhydrous | Sigma-Aldrich | 746398 | |
Sucrose | Sigma-Aldrich | S7903 | BioXtra, ≥99.5% (GC) |
Time-pregnant female C57BL/6 mice | Texas A&M Institue for Genomic Medicine | ||
Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | 500 mL |
Wide-bore blue pipette tips P1000 | VWR | 83007-380 |