概要

في الموقع Chemotaxis اختبار لفحص السلوك الميكروبي في النظم الإيكولوجية المائية

Published: May 05, 2020
doi:

概要

يُعرض هنا البروتوكول الخاص بـ اختبار كميكوتاكس في الموقع، وهو جهاز microfluidic تم تطويره مؤخرًا ويمكّن من إجراء دراسات للسلوك الميكروبي مباشرة في البيئة.

Abstract

السلوكيات الميكروبية، مثل حركية وchemotaxis (قدرة الخلية على تغيير حركتها استجابة للتدرج الكيميائي)، تنتشر على نطاق واسع عبر المجالات البكتيرية والعتقية. يمكن أن ينتج عن Chemotaxis مزايا كبيرة في الحصول على الموارد في بيئات غير متجانسة. كما تلعب دوراً حاسماً في التفاعلات التكافلية، والمرض، والعمليات العالمية، مثل الدراجات الكيميائية الحيوية. ومع ذلك، فإن التقنيات الحالية تقيد بحوث الchemotaxis بالمختبر ولا يمكن تطبيقها بسهولة في هذا المجال. يُعرض هنا بروتوكول خطوة بخطوة لنشر مقايسة الأوموتاكسيس في الموقع (ISCA)، وهو جهاز يمكّن من الاستجواب القوي لخموتاكسيس الميكروبات مباشرة في البيئة الطبيعية. وICCA هو جهاز microfluidic تتكون من مجموعة 20 بئر، والتي يمكن تحميل المواد الكيميائية ذات الأهمية. وبمجرد نشرها في بيئات مائيّة، تنتشر المواد الكيميائية خارج الآبار، مما يخلق تدرجات تركيز تستشعرها الميكروبات وتستجيب لها بالسباحة في الآبار عبر الآبار. ويمكن بعد ذلك أخذ عينات من محتويات البئر واستخدامها في (1) قياس قوة الاستجابات الكيميائية لمركبات محددة من خلال قياس الخلايا المتدفقة، (2) عزل الكائنات الدقيقة المتجاوبة وثقافتها، (3) توصيف هوية السكان المستجيبين وإمكاناتهم الجينية من خلال التقنيات الجزيئية. و ISCA هو منصة مرنة يمكن نشرها في أي نظام مع مرحلة مائي، بما في ذلك البيئة البحرية والمياه العذبة والتربة.

Introduction

الكائنات الحية الدقيقة المتنوعة استخدام الحركة وchemotaxis لاستغلال البيئات غير مكتمل المغذيات، والعثور على المضيفين، أو تجنب الظروف الضارة1،2،3. ويمكن أن تؤثر هذه السلوكيات الميكروبية بدورها على معدلات التحول الكيميائي4 وأن تعزز الشراكات التكافلية عبر النظم الإيكولوجية الأرضية والمياه العذبة والنظم الإيكولوجية البحرية2،5.

وقد درست على نطاق واسع Chemotaxis تحت ظروف المختبرات على مدى السنوات ال 60 الماضية6. الطريقة الكمية الأولى لدراسة chemotaxis ، المقايسة الشعرية ، ينطوي على أنبوب شعري مملوءة بكيموااتtractant المفترضة مغمورة في تعليق البكتيريا6. نشر المادة الكيميائية من الأنبوب يخلق تدرج كيميائي، والبكتيريا الكيميائية تستجيب لهذا التدرج عن طريق الهجرة إلى الأنبوب7. منذ تطور المقايسة الشعرية ، لا تزال تستخدم على نطاق واسع اليوم ، وقد تم تطوير العديد من التقنيات الأخرى لدراسة chemotaxis تحت ظروف فيزيائية / كيميائية تسيطر عليها بشكل متزايد ، مع أحدثها التي تنطوي على استخدام microfluidics8،9،10.

Microfluidics، جنبا إلى جنب مع المجهر الفيديو عالية السرعة، تمكن من تتبع سلوك الخلايا الفردية استجابة لتدرجات تسيطر عليها بعناية. وعلى الرغم من أن هذه التقنيات قد حسنت إلى حد كبير فهمنا لخموتاكسيس، إلا أنها اقتصرت على الاستخدام المختبري ولا تترجم بسهولة إلى النشر الميداني في النظم البيئية. ونتيجة لذلك، لم يتم فحص قدرة المجتمعات الطبيعية من البكتيريا على استخدام البكيميوتاكسيس داخل النظم الإيكولوجية الطبيعية؛ وهكذا، فإن الفهم الحالي للأهمية البيئية المحتملة لخميموتاكسيس منحاز لظروف المختبر الاصطناعي وعدد محدود من عزل البكتيريا المستزرعة في المختبرات. وSCA وضعت مؤخرا يتغلب على هذه القيود11.

وSCA يبني على المبدأ العام من المقايسة الشعرية; ومع ذلك، فإنه يجعل من استخدام تقنيات microfabrication الحديثة لتقديم منصة تجريبية منسوخة للغاية، يمكن الانتشار بسهولة لتحديد كمي من chemotaxis نحو مركبات ذات فائدة في البيئة الطبيعية. كما يسمح بتحديد وتوصيف الكائنات الحية الدقيقة الكيميائية عن طريق العزل المباشر أو التقنيات الجزيئية. في حين أن أول جهاز عمل كان ذاتي التصنيع وشيد من الزجاج و PDMS11، فإن أحدث نسخة مصبوب حقن يتكون من البولي ، وذلك باستخدام إجراء تصنيع موحدة للغاية (لمصلحة في أحدث إصدار من الجهاز ، يمكن الاتصال المؤلفين المقابلة).

وتتميز هذه الآبار بحجم بطاقة الائتمان، وتتألف من 20 بئراً موزعة في صفيف آبار 5 × 4، يرتبط كل منها بالبيئة المائية الخارجية بواسطة ميناء صغير (قطره 800 ميكرومتر؛ و20 بئراً من الآبار، و 400 ميكرومتر، و100 ميكرومتر، و100 100 متر، و100 ميكرو متر، و100 100 متر، و150 ميكرو، و1000 ميكرو، و1999، و1999،100 متر مربع، و 2000 متر مربع، و 100 ميكرومتر، و 100 الشكل 1). المواد الكيميائية المفترضة المحملة في الآبار تنتشر في البيئة عبر الميناء ، والميكروبات الكيميائية تستجيب عن طريق السباحة من خلال الميناء في البئر. وبما أن العديد من العوامل يمكن أن تؤثر على نتائج تجربة ISCA في البيئة الطبيعية، فإن هذا البروتوكول خطوة بخطوة سوف يساعد المستخدمين الجدد على التغلب على العقبات المحتملة وتسهيل عمليات النشر الفعالة.

Protocol

نوصي بتنفيذ القسم 1 قبل التجارب الميدانية لتحسين النتائج. 1. مختبر التحسين ملاحظة: وحدات التخزين الموضحة في الإجراء الأمثل كافية لـ ISCA واحد (يتكون من 20 بئر). إعداد المادة الكيميائية ذات الأهميةملاحظة: غالباً ما يحتاج التركيز الأمثل لكل مُتراكٍ كيميائي ?…

Representative Results

يعرض هذا القسم نتائج المختبر باستخدام ISCA لاختبار الاستجابة الكيميائية للميكروبات البحرية إلى نطاق تركيز الجلوتامين ، وهو حمض أميني معروف لجذب بكتيريا التربة14. وقد استخدم تركيز الجلوتامين الذي أثار أقوى استجابة كيميائية في الاختبارات المخبرية لإجراء فحص كميموتكس في البيئة …

Discussion

على نطاق الكائنات الحية الدقيقة المائية، والبيئة بعيدة كل البعد عن التجانس وغالبا ما تتميز بالتدرجات الفيزيائية/الكيميائية التي تُهيّن المجتمعات الميكروبية,15. قدرة الكائنات الحية الدقيقة motile على استخدام السلوك (أي chemotaxis) يسهل الأعلاف داخل هذه البيئة ال?…

開示

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

تم تمويل هذا البحث جزئيا من قبل مبادرة الأحياء الدقيقة البحرية مؤسسة غوردون وبيتي مور، من خلال منحة GBMF3801 إلى J.R.S. وR.S.، وجائزة المحقق (GBMF3783) إلى R.S.، فضلا عن زمالة مجلس البحوث الأسترالي (DE160100636) إلى J.B.R. ، وهي جائزة من مؤسسة سيمونز إلى B.S.L. (594111) ، ومنحة من مؤسسة سيمونز (542395) إلى R.S. كجزء من مبادئ النظم الإيكولوجية الميكروبية (PriME) التعاونية.

Materials

Acrylic glue Evonik 1133 Acrifix 1S 0116
Acrylic sheet McMaster-Carr 8505K725 Or different company
Adhesive tape Scotch 3M 810 Scotch Magic tape
Autoclave Systec D-200 Or different company
Benchtop centrifuge Fisher Scientific 75002451 Or different company
Bungee cord Paracord Planet 667569184000 Or different company
Centrifuge tube – 2 mL Sigma Aldrich BR780546-500EA Eppendorf tube
Conical centrifuge tube – 15 mL Fisher Scientific 11507411 Falcon tube
Conical centrifuge tube – 50 mL Fisher Scientific 10788561 Falcon tube
Deployment arm Irwin 1964719 Or different company
Deployment enclosure plug Fisher Scientific 21-236-4 See alternatives in manuscript
Disposable wipers Kimtech – Fisher Scientific 06-666 Kimwipes
Flow cytometer Beckman C09756 CYTOFlex
Glutaraldehyde 25% Sigma Aldrich G5882 Or different company
Green fluorescent dye Sigma Aldrich S9430 SYBR Green I – 1:10,000 final dilution
Hydrophilic GP filter cartridge – 0.2 µm Merck C3235 Sterivex filter
In Situ Chemotaxis Assay (ISCA) Contact corresponding authors
Laser cutter Epilog Laser Fusion pro 32 Or different company
Luria Bertani Broth Sigma Aldrich L3022 Or different company
Marine Broth 2216 VWR 90004-006 Difco
Nylon slotted flat head screws McMaster-Carr 92929A243 M 2 × 4 × 8 mm
Pipette set Fisher Scientific 05-403-151 Or different company
Pipette tips – 1 mL Fisher Scientific 21-236-2A Or different company
Pipette tips – 20 µL Fisher Scientific 21-236-4 Or different company
Pipette tips – 200 µL Fisher Scientific 21-236-1 Or different company
Sea salt Sigma Aldrich S9883 For artificial seawater
Serological pipette – 50 mL Sigma Aldrich SIAL1490-100EA Or different company
Syringe filter – 0.02 µm Whatman WHA68091002 Anatop filter
Syringe filter – 0.2 µm Fisher Scientific 10695211 Or different company
Syringe needle 27G Henke Sass Wolf 4710004020 0.4 × 12 mm
Syringes – 1 mL Codau 329650 Insulin Luer U-100
Syringes – 10 mL BD 303134 Or different company
Syringes – 50 mL BD 15899152 Or different company
Tube rack – 15 mL Thomas Scientific 1159V80 Or different company
Tube rack – 50 mL Thomas Scientific 1159V80 Or different company
Uncoated High-Speed Steel General Purpose Tap McMaster-Carr 8305A77 Or different company
Vacuum filter – 0.2 µm Merck SCGPS05RE Steritop filter

参考文献

  1. Stocker, R. Marine microbes see a sea of gradients. Science. 338, 628-633 (2012).
  2. Raina, J. B., Fernandez, V., Lambert, B., Stocker, R., Seymour, J. R. The role of microbial motility and chemotaxis in symbiosis. Nature Reviews Microbiology. 17, 284-294 (2019).
  3. Chet, I., Asketh, P., Mitchell, R. Repulsion of bacteria from marine surfaces. Applied Microbiology. 30, 1043-1045 (1975).
  4. Smriga, S., Fernandez, V. I., Mitchell, J. G., Stocker, R. Chemotaxis toward phytoplankton drives organic matter partitioning among marine bacteria. PNAS. 113, 1576-1581 (2016).
  5. Matilla, M., Krell, T. The effect of bacterial chemotaxis on host infection and pathogenicity. FEMS Microbiology Reviews. 42, (2018).
  6. Adler, J. Chemotaxis in bacteria. Science. 153, 708-716 (1966).
  7. Adler, J., Dahl, M. M. A method for measuring the motility of bacteria and for comparing random and non-random motility. Journal of General Microbiology. 46, 161-173 (1967).
  8. Ahmed, T., Shimizu, T. S., Stocker, R. Microfluidics for bacterial chemotaxis. Integrative Biology. 2, 604-629 (2010).
  9. Hol, F. J. H., Dekker, C. Zooming in to see the bigger picture: microfluidic and nanofabrication tools to study bacteria. Science. 346, 1251821 (2014).
  10. Rusconi, R., Garren, M., Stocker, R. Microfluidics expanding the frontiers of microbial ecology. Annual Review of Biophysics. 43, 65-91 (2014).
  11. Lambert, B. S., et al. A microfluidics-based in situ chemotaxis assay to study the behaviour of aquatic microbial communities. Nature Microbiology. 2, 1344-1349 (2017).
  12. Marie, D., Partensky, F., Jacquet, S., Vaulot, D. Enumeration and cell cycle analysis of natural populations of marine picoplankton by flow cytometry using the nucleic acid stain SYBR Green I. Applied Environmental Microbiology. 63, 186-193 (1997).
  13. Rinke, C., et al. Obtaining genomes from uncultivated environmental microorganisms using FACS-based single-cell genomics. Nature Protocols. 9, 1038-1048 (2014).
  14. Gaworzewska, E. T., Carlile, M. J. Positive chemotaxis of Rhizobium leguminosarum and other bacteria towards root exudates from legumes and other plants. 微生物学. , (1982).
  15. Walker, T. S., Bais, H. P., Grotewold, E., Vivanco, J. M. Root exudation and rhizosphere biology. Plant Physiology. 132, 44-51 (2003).

Play Video

記事を引用
Clerc, E. E., Raina, J., Lambert, B. S., Seymour, J., Stocker, R. In Situ Chemotaxis Assay to Examine Microbial Behavior in Aquatic Ecosystems. J. Vis. Exp. (159), e61062, doi:10.3791/61062 (2020).

View Video