概要

在西图化学分析中,以检验水生生态系统中的微生物行为

Published: May 05, 2020
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概要

这里介绍的是原位化疗的规程,这是一种最近开发的微流体装置,能够直接研究环境中的微生物行为。

Abstract

微生物行为,如运动和化学(细胞改变其运动的能力,以响应化学梯度),在细菌和古生物领域广泛。在异构环境中,Chemotaxis 可产生巨大的资源获取优势。它还在共生相互作用、疾病和全球过程(如生物地球化学循环)中发挥关键作用。然而,目前的技术将化疗研究限制在实验室,并不容易应用于该领域。此处介绍的是部署原位化学测定 (ISCA) 的分步协议,该装置可直接在自然环境中对微生物化疗进行强健的检测。ISCA 是一种微流体装置,由 20 井阵列组成,可装载感兴趣的化学品。一旦部署在水环境中,化学物质会从水井中扩散出来,产生微生物通过化疗游入水井来感知和响应的浓度梯度。然后,可以对井内物质进行采样,并用于(1) 通过流式细胞学量化对特定化合物的化疗反应强度,(2) 分离和培养反应灵敏的微生物,(3) 通过分子技术描述反应群体的身份和基因组潜力。ISCA 是一个灵活的平台,可部署在水相的任何系统中,包括海洋、淡水和土壤环境。

Introduction

不同的微生物利用动力和化学利用来利用零碎的营养环境,寻找宿主,或避免有害条件1,1,2,3。,3这些微生物行为反过来又会影响化学转化率4,并促进陆地、淡水和海洋生态系统2、5共生伙伴关系

在过去的60年里,切莫塔西在实验室条件下进行了广泛的研究。研究化疗的第一个定量方法,毛细管测定,涉及一个毛细管充满了悬浮在细菌6的悬浮中。从管子中扩散出的化学物质会产生化学梯度,而化学细菌通过迁移到管7来响应这种梯度。自毛细管测定开发以来,目前仍然广泛使用,在日益受控的物理/化学条件下,还开发了许多其他技术来研究化学化学,最近涉及使用微流体8、9、10。,9,10

微流体与高速视频显微镜一起,能够跟踪单个细胞的行为,以响应精心控制的梯度。虽然这些技术极大地提高了我们对化疗的了解,但它们仅限于实验室使用,不容易转化为环境系统中的实地部署。因此,没有检查细菌自然群落在自然生态系统内使用化学药物的能力;因此,目前对化疗的潜在生态重要性的理解偏向于人工实验室条件和数量有限的实验室培养的细菌分离物。最近开发的 ISCA 克服了这些限制11

ISCA以毛细管测定的一般原则为上;然而,它利用现代微制造技术,提供一个高度复制的、易于部署的实验平台,用于对自然环境中感兴趣的化合物进行化学化学的定量化。它还允许通过直接隔离或分子技术识别和鉴定化疗微生物。虽然第一个工作装置是玻璃和PDMS11自行制造和制造的,但最新的注塑成型版本由聚碳酸酯组成,采用高度标准化的制造程序(对于最新版本的装置感兴趣,可以联系相应的作者)。

ISCA 是信用卡大小的,由 20 口井组成,分布在 5 x 4 孔阵列中,每个井通过一个小端口(直径 800 μm)与外部水生环境相连; 图1)。装入井中的放药化疗物通过港口扩散到环境中,化疗微生物通过港口游入井中作出反应。由于许多因素会影响自然环境中的 ISCA 实验结果,因此此分步协议将帮助新用户克服潜在障碍并促进有效部署。

Protocol

我们建议在实地实验之前执行第 1 节以优化结果。 1. 实验室优化 注:优化过程中描述的体积足以满足单个 ISCA(由 20 口井组成)。 感兴趣的化学品的制备注:在实地部署之前,通常需要在实验室条件下确定每种化疗物的最佳浓度。化学浓度场将随着与源的距离(ISCA井)而减少,这意味着环境中微生物经历的浓度将低于设备内部的浓度。在 ISCA…

Representative Results

本节介绍实验室结果,利用 ISCA 测试海洋微生物对谷氨酰胺浓度范围的化学反应,谷氨酰胺是一种已知能吸引土壤细菌的氨基酸。在实验室测试中引起最强化学反应的谷氨酰胺浓度用于在海洋环境中进行化学测定。 为了进行实验室测试,从澳大利亚悉尼沿海水域取样的海水群落通过简单的营养修正4(如步骤1.4所述)为动体细胞提供了丰富?…

Discussion

在水生微生物的规模上,环境远非同质,其特征往往是物理/化学梯度,这些梯度结构微生物群落1,1,15。动性微生物使用行为的能力(即化疗)有助于在这些异质微环境中觅食1。直接在环境中研究化学化学具有识别重要特异性相互作用和化学偏好的潜力,这可以帮助解开特定微生物对生物地球化学过程的贡献。提出的协议将 ISCA 部署?…

開示

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

这项研究部分由戈登和贝蒂摩尔基金会海洋微生物学倡议资助,通过向J.R.S.和R.S.提供GBMF3801赠款, 向R.S.颁发调查员奖(GBMF3783),向J.B.R颁发澳大利亚研究理事会研究金(DE160100636),西蒙斯基金会向B.S.L.(594111.)颁发奖项,西蒙斯基金会(542395)向R.S.颁发资助,作为微生物生态系统原则(PriME)合作的一部分。

Materials

Acrylic glue Evonik 1133 Acrifix 1S 0116
Acrylic sheet McMaster-Carr 8505K725 Or different company
Adhesive tape Scotch 3M 810 Scotch Magic tape
Autoclave Systec D-200 Or different company
Benchtop centrifuge Fisher Scientific 75002451 Or different company
Bungee cord Paracord Planet 667569184000 Or different company
Centrifuge tube – 2 mL Sigma Aldrich BR780546-500EA Eppendorf tube
Conical centrifuge tube – 15 mL Fisher Scientific 11507411 Falcon tube
Conical centrifuge tube – 50 mL Fisher Scientific 10788561 Falcon tube
Deployment arm Irwin 1964719 Or different company
Deployment enclosure plug Fisher Scientific 21-236-4 See alternatives in manuscript
Disposable wipers Kimtech – Fisher Scientific 06-666 Kimwipes
Flow cytometer Beckman C09756 CYTOFlex
Glutaraldehyde 25% Sigma Aldrich G5882 Or different company
Green fluorescent dye Sigma Aldrich S9430 SYBR Green I – 1:10,000 final dilution
Hydrophilic GP filter cartridge – 0.2 µm Merck C3235 Sterivex filter
In Situ Chemotaxis Assay (ISCA) Contact corresponding authors
Laser cutter Epilog Laser Fusion pro 32 Or different company
Luria Bertani Broth Sigma Aldrich L3022 Or different company
Marine Broth 2216 VWR 90004-006 Difco
Nylon slotted flat head screws McMaster-Carr 92929A243 M 2 × 4 × 8 mm
Pipette set Fisher Scientific 05-403-151 Or different company
Pipette tips – 1 mL Fisher Scientific 21-236-2A Or different company
Pipette tips – 20 µL Fisher Scientific 21-236-4 Or different company
Pipette tips – 200 µL Fisher Scientific 21-236-1 Or different company
Sea salt Sigma Aldrich S9883 For artificial seawater
Serological pipette – 50 mL Sigma Aldrich SIAL1490-100EA Or different company
Syringe filter – 0.02 µm Whatman WHA68091002 Anatop filter
Syringe filter – 0.2 µm Fisher Scientific 10695211 Or different company
Syringe needle 27G Henke Sass Wolf 4710004020 0.4 × 12 mm
Syringes – 1 mL Codau 329650 Insulin Luer U-100
Syringes – 10 mL BD 303134 Or different company
Syringes – 50 mL BD 15899152 Or different company
Tube rack – 15 mL Thomas Scientific 1159V80 Or different company
Tube rack – 50 mL Thomas Scientific 1159V80 Or different company
Uncoated High-Speed Steel General Purpose Tap McMaster-Carr 8305A77 Or different company
Vacuum filter – 0.2 µm Merck SCGPS05RE Steritop filter

参考文献

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記事を引用
Clerc, E. E., Raina, J., Lambert, B. S., Seymour, J., Stocker, R. In Situ Chemotaxis Assay to Examine Microbial Behavior in Aquatic Ecosystems. J. Vis. Exp. (159), e61062, doi:10.3791/61062 (2020).

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