概要

Isolamento e cultura de células-tronco neurais embrionárias de rato

Published: November 11, 2018
doi:

概要

Aqui, apresentamos uma nova técnica microcirúrgica para o isolamento de células-tronco neurais da Eminência ganglionar embrião de rato E13 .

Abstract

Células-tronco neurais (NSCs) são multipotentes e pode dar origem a três tipos principais de célula do sistema nervoso central (SNC). Cultura in vitro e expansão de NSCs fornecem uma fonte adequada de células para neurocientistas estudar a função dos neurônios e células gliais, juntamente com suas interações. Existem várias técnicas relatadas para o isolamento de células-tronco neurais do cérebro de mamíferos adultos ou embrião. Durante a operação microcirúrgica para isolar NSCs de diferentes regiões do SNC embrionário, é muito importante reduzir os danos ao cérebro células para obter o rácio mais elevado de células-tronco ao vivo e expansíveis. Uma possível técnica para redução de estresse durante o isolamento dessas células do cérebro do rato embrião é a redução do tempo cirúrgico. Aqui, vamos demonstrar uma técnica desenvolvida para rápida isolamento dessas células da Eminência ganglionar embrião de rato E13 . Os procedimentos cirúrgicos incluem a colheita de embriões de rato E13 do útero, cortando a fontanela frontal do embrião com uma ponta de agulha torta, extraindo o cérebro do crânio, microdissection do cérebro isolado para colher a Eminência ganglionar, dissociação do tecido colhido no meio de NSC para obter uma suspensão de célula única e, finalmente, chapeamento de células em cultura de suspensão para gerar neurospheres.

Introduction

Células-tronco neurais (NSCs) residem em diferentes regiões do cérebro adulto e embrião e eles têm uma tendência a gerar diferentes tipos de neurônios e células gliais1. Zona subventricular no cérebro de mamíferos adultos2 e Eminência ganglionar do cérebro do embrião são regiões ricas de NSC3. No cérebro em desenvolvimento, a Eminência ganglionar oferece a maioria dos interneurônios corticais e particularmente gabaérgica interneurônios3. Também existem métodos menos invasivos para a geração de células-tronco neurais de células-tronco embrionárias (CES) ou uso de células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs) que reduzem a demanda por animal. Apesar do fato de que gerar NSCs de CES ou iPSCs é possível4,5, tem algumas vantagens e desvantagens em comparação com o isolamento de células-tronco neurais do adulto ou embrião cérebro6,7, 8. Os protocolos para induzir a diferenciação de CES e iPSCs em direção a fenótipos neuronais são sempre tempo e custo de consumo e a taxa de sucesso (70-80% Nestin células positivas)5 é mais baixo comparada com isolamento direto de NSCs o cérebro animal ( mais de 99% Nestin células positivas)9. Além disso, as células-tronco perdem sua tendência de estabilidade e diferenciação genética após várias passagens10,11. Embora existam outros novos relatórios sobre a conversão direta de células somáticas em NSCs, estas células são geneticamente e não são facilmente acessíveis em cada laboratório12. Portanto, ainda há uma grande demanda por isolamento de células-tronco neurais do cérebro animal; é possível reduzir a quantidade de uso animal, melhorando as técnicas cirúrgicas. Reduzindo o tempo cirúrgico e melhorar as técnicas, é possível manter as células de danos e obter a maior taxa de NSCs de cada animal.

Aqui, apresentamos uma técnica simplificada e reprodutível para isolamento de células-tronco neurais do cérebro de embrião do rato E13 .

Protocol

Todas as cirurgias e procedimentos em animais, foram aprovados pelo Comitê de ética animal do Instituto de Royan, Teerã, Irã. 1. preparação dos instrumentos cirúrgicos, lavagem Buffer (HEPES-MEM), meios de cultura celular e placas de cultura de células Esterilize os instrumentos cirúrgicos (tesouras, punho de lâmina de bisturi e pinça) por autoclave-los baseados nas orientações da rotina de esterilização. Preparar um volume adequado de tampão HEPES-MEM (cerc…

Representative Results

Micro-dissecção, cela de isolamento e cultura de Neurosphere. Aqui, apresentamos um método rápido e eficiente para o isolamento de células-tronco neurais e Microcirurgia de cérebro do rato E13 . Este artigo mostra que é possível remover o cérebro de um crânio de embrião de rato de13 E através de uma ruptura bem na fontanela frontal. Com esse método, o cérebro sofre menos dano e é possível isolar as células de diferentes partes do cé…

Discussion

Usar uma fonte adequada de células-tronco neurais é muito importante para os neurocientistas. Células-tronco neurais pode ser colhidas de diferentes áreas do cérebro do embrião e podem gerar tipos específicos de neurônios e células gliais. Existem vários métodos para a indução da diferenciação de células-tronco neurais para induzi-los a gerar neurônios maduros e células gliais. Há inúmeros relatos indicando que em condições de cultura específica e regimentos fator trófico, poderia gerar neurônios…

開示

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este trabalho foi financiado pelo Instituto de Royan.

Materials

15 mL tubes Falcon 352097
50 mL tubes Falcon 352235
Adson Forceps, 12 cm, Straight WPI 14226
B27 Gibco 17504-44
bFGF Sigma F0291
bovine serum albumin (BSA) Sigma A2153
dish 10cm  Falcon 353003
Dressing Forceps, 12.5 cm, Straight WPI 15908
Dumont Tweezers, 11 cm, Straight WPI 500342
EGF Sigma E9644
Ethanol Merck 100983 
Glutamate Sigma  G3291
Glutamax Gibco 35050061
goat anti rabbit FITC conjugated secondary antibody Sigma AP307F
goat serum Sigma G9023
Heparin   Sigma h3149
HEPES Sigma 83264
HEPES Sigma 90909C
insulinsyringe with 25-27 gauge Needle  SUPA medical A1SNL127
laminin sigma    L2020
MEM Sigma M2279
N2 supplement Gibco 17502048
NB medium Gibco 21103-31
Non-essential amino acid (NEAA) Gibco 11140050
PBS without Ca and Mg Gibco 20012050
Penicilin/ Streptomycin Gibco 5140122
Poly-L-ornithine Sigma  P4957
rabbit anti mouse beta tubulin-III antibody Sigma T2200
rabbit anti mouse GFAP antibody Sigma G4546
rabbit anti mouse Nestin antibody Sigma N5413
Scalpel Handle #3 WPI 500236
Scissors curve WPI 14396
Scissors sharp straight WPI 14192
Soybean trypsin inhibitor Roche 10109886001 
Tissue culture flasks, T25 BD 353014
Tissue culture flasks, T75 BD 353024
Tween 20 Sigma P1379
Vannas Scissors,  8 cm, Straight  WPI 14003
β-mercaptoethanol Sigma M6250

参考文献

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記事を引用
Homayouni Moghadam, F., Sadeghi-Zadeh, M., Alizadeh-Shoorjestan, B., Dehghani-Varnamkhasti, R., Narimani, S., Darabi, L., Kiani Esfahani, A., Nasr Esfahani, M. H. Isolation and Culture of Embryonic Mouse Neural Stem Cells. J. Vis. Exp. (141), e58874, doi:10.3791/58874 (2018).

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