절연 및 마우스 배아 신경 줄기 세포의 문화
概要
여기, 전자13 마우스 배아 절 예 하에서 신경 줄기 세포의 분리에 대 한 새로운 microsurgical 기술을 소개합니다.
Abstract
신경 줄기 세포 (NSCs) multipotent 이며 중앙 신경 시스템 (CNS)의 세 가지 주요 셀 형식을 야기할 수 있습니다. 생체 외에서 문화 및 확장 NSCs의 신경의 기능을 연구 하는 신경에 대 한 셀 및 그들의 상호 작용을 함께 glial 세포의 적당 한 소스를 제공 합니다. 성인 또는 배아 포유류 두뇌에서 신경 줄기 세포의 분리에 대 한 몇 가지 보고 된 기술이 있다. NSCs 배아 CNS의 다른 지구에서 격리를 microsurgical 동안, 라이브 및 확장 가능한 줄기 세포의 가장 높은 비율을 얻기 위해 뇌 세포에 피해를 줄이기 위해 매우 중요 하다. 쥐 태아의 뇌에서이 세포의 고립 동안 스트레스 감소를 위한 가능한 방법은 수술 시간의 감소입니다. 여기, 우리 E13 마우스 배아 절 예 하에서 이러한 셀의 빠른 격리 개발된 기술을 보여 줍니다. 수술 절차 포함 절단 정면 온 두개골, 수확 절 예 하 고립 된 두뇌의 기정에서에서 두뇌를 추출 구부러진된 바늘 팁, 태아의 자 궁에서 E13 마우스 배아를 수확 단일 셀 서 스 펜 션을 얻기 위해 NSC 매체에 수확된 조직 그리고 마지막으로 neurospheres를 생성 하기 위해 현 탁 액 문화에서 도금 셀의 분리.
Introduction
신경 줄기 세포 (NSCs) 성인과 태아 두뇌의 다른 지역에 있으며 그들은 신경 그리고 glial 세포1의 다른 종류를 생성 하는 경향이 있다. 2 성인 포유류 두뇌 subventricular 영역 및 태아 두뇌에 예 절 하는 NSC 풍부한 지역3. 개발 두뇌 절 예 하는 대뇌 피 질의 수 및 특히 GABAergic 수3의 대부분을 제공합니다. 또한 더 적은 침략 적 방법이 있다 미 발달 줄기 세포 (ESCs)에서 신경 줄기 세포 생성에 대 한 또는 동물에 대 한 수요 감소 유도 만능 줄기 세포 (Ipsc) 사용. ESCs 또는 Ipsc NSCs를 생성 하는 것이 가능한4,5는 사실에도 불구 하 고 그것은 몇 가지 장단점이 성인 또는 태아 뇌6,7, 신경 줄기 세포의 분리에 비해 8. ESCs와 신경 고기 향해 Ipsc의 분화 유도 대 한 프로토콜은 항상 시간과 비용을 소모 하 고 성공 (70-80 %Nestin 양성 세포)5 속도 낮은 동물 뇌 (NSCs의 직접 절연 비교 이상 99 %Nestin 양성 세포)9. 또한, 줄기 세포는 여러 구절10,11후 그들의 유전적 안정성과 차별화 추세를 잃게됩니다. 비록 NSCs로 체세포의 직접 변환에 대 한 다른 새로운 보고서는,이 세포 유전자 조작 하 고 모든 랩12에 쉽게 액세스할 수 있습니다. 따라서, 거기는 여전히; 동물 뇌에서 신경 줄기 세포의 분리에 대 한 큰 수요가 그것은 수술 기법을 개선 하 여 동물 사용의 수량을 줄일 수 있습니다. 수술 시간을 단축 하 고 기술을 개선, 그것은 손상에서 세포를 유지 하 고 각 동물에서 NSCs의 가장 높은 속도 얻을 수 있습니다.
여기, 우리는 마우스 E13 태아 뇌에서 신경 줄기 세포의 분리에 대 한 단순 하 고 재현할 수 기법을 소개합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
신경 줄기 세포의 적합 한 소스를 사용 하 여 하는 것은 신경에 대 한 매우 중요 합니다. 신경 줄기 세포는 태아 두뇌의 다른 지역에서 수확 될 수 그리고 그들은 신경 그리고 glial 세포의 특정 유형을 생성할 수 있습니다. 성숙한 신경 그리고 glial 세포를 생성 하도록 유도 하는 신경 줄기 세포의 분화의 유도 대 한 몇 가지 방법이 있다. 수많은 보고서를 나타내는 특정 문화권 조건과 영양 요소 연대…
開示
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은로 양 연구소에 의해 지원 되었다.
Materials
| 15 mL tubes | Falcon | 352097 | |
| 50 mL tubes | Falcon | 352235 | |
| Adson Forceps, 12 cm, Straight | WPI | 14226 | |
| B27 | Gibco | 17504-44 | |
| bFGF | Sigma | F0291 | |
| bovine serum albumin (BSA) | Sigma | A2153 | |
| dish 10cm | Falcon | 353003 | |
| Dressing Forceps, 12.5 cm, Straight | WPI | 15908 | |
| Dumont Tweezers, 11 cm, Straight | WPI | 500342 | |
| EGF | Sigma | E9644 | |
| Ethanol | Merck | 100983 | |
| Glutamate | Sigma | G3291 | |
| Glutamax | Gibco | 35050061 | |
| goat anti rabbit FITC conjugated secondary antibody | Sigma | AP307F | |
| goat serum | Sigma | G9023 | |
| Heparin | Sigma | h3149 | |
| HEPES | Sigma | 83264 | |
| HEPES | Sigma | 90909C | |
| insulinsyringe with 25-27 gauge Needle | SUPA medical | A1SNL127 | |
| laminin | sigma | L2020 | |
| MEM | Sigma | M2279 | |
| N2 supplement | Gibco | 17502048 | |
| NB medium | Gibco | 21103-31 | |
| Non-essential amino acid (NEAA) | Gibco | 11140050 | |
| PBS without Ca and Mg | Gibco | 20012050 | |
| Penicilin/ Streptomycin | Gibco | 5140122 | |
| Poly-L-ornithine | Sigma | P4957 | |
| rabbit anti mouse beta tubulin-III antibody | Sigma | T2200 | |
| rabbit anti mouse GFAP antibody | Sigma | G4546 | |
| rabbit anti mouse Nestin antibody | Sigma | N5413 | |
| Scalpel Handle #3 | WPI | 500236 | |
| Scissors curve | WPI | 14396 | |
| Scissors sharp straight | WPI | 14192 | |
| Soybean trypsin inhibitor | Roche | 10109886001 | |
| Tissue culture flasks, T25 | BD | 353014 | |
| Tissue culture flasks, T75 | BD | 353024 | |
| Tween 20 | Sigma | P1379 | |
| Vannas Scissors, 8 cm, Straight | WPI | 14003 | |
| β-mercaptoethanol | Sigma | M6250 |
参考文献
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