Aislamiento y cultivo de las células madre neurales embrionarias de ratón
概要
Aquí, presentamos una nueva técnica microquirúrgica para el aislamiento de las células madre neurales de la eminencia gangliónica E13 ratón embrión.
Abstract
Las células madre neurales (NSC) son multipotentes y puede dar lugar a los tres tipos de células importantes del sistema nervioso central (SNC). In vitro cultura y expansión de NSCs proporcionan una fuente adecuada de células de neurocientíficos a estudiar la función de las neuronas y células gliales junto con sus interacciones. Existen varias técnicas divulgadas para el aislamiento de las células madre neurales del cerebro mamífero adulto o embrionario. Durante la operación de microcirugía para aislar NSCs de diferentes regiones del SNC embrionario, es muy importante reducir el daño a las células del cerebro para obtener el cociente más alto de células vivas y ampliables. Una técnica posible para reducir el estrés durante el aislamiento de estas células en el cerebro de embriones de ratón es la reducción del tiempo quirúrgico. Aquí, demostramos una técnica desarrollada para el aislamiento rápido de estas células de la eminencia gangliónica E13 ratón embrión. Los procedimientos quirúrgicos incluyen embriones de ratón de13 E desde el útero, la fontanela frontal de los embriones con una punta de la aguja doblada, extracción del cerebro del cráneo, microdisección del cerebro aislado para cosechar la eminencia gangliónica, de corte disociación de los tejidos cosechados en medio de la NSC para obtener una suspensión unicelular y, finalmente, chapado en células en cultivo de suspensión que generan neuroesferas.
Introduction
Las células madre neurales (NSC) residen en diferentes regiones del cerebro adulto y el embrión y que tienen una tendencia a generar diferentes tipos de neuronas y células gliales1. Las zonas subventricular del cerebro adulto de mamíferos2 y eminencia ganglionar en el cerebro del embrión son de las regiones ricas de NSC3. En el cerebro en desarrollo, la eminencia gangliónica ofrece la mayoría de las interneuronas corticales y particularmente de interneuronas de GABAérgico3. También hay métodos menos invasivos para la generación de células madre neuronales de las células madre embrionarias (ESCs) o uso de células madre pluripotentes inducidas (iPSCs) que reducen la demanda para el animal. A pesar de que la generación de NSCs de CES o iPSCs es posible4,5, tiene algunas ventajas y desventajas en comparación con el aislamiento de las células madre neurales del adulto o embrionario cerebro6,7, 8. Los protocolos para la inducción de la diferenciación del CES y iPSCs hacia fenotipos neuronales son siempre tiempo y coste de consumo y la tasa de éxito (70-80% Nestin las células positivas)5 es inferior comparada con aislamiento directo de NSCs del (cerebro animal más de 99% Nestin las células positivas)9. Por otra parte, las células madre pierden su tendencia genética de la diferenciación y estabilidad después de varios pasajes10,11. Aunque hay otros nuevos informes acerca de la conversión directa de células somáticas en NSCs, estas células son genéticamente modificadas y no son fácilmente accesibles en cada laboratorio12. Por lo tanto, todavía hay una gran demanda para el aislamiento de las células madre neurales del cerebro animal; es posible reducir la cantidad de uso animal mediante la mejora de las técnicas quirúrgicas. Reduciendo el tiempo quirúrgico y mejora de las técnicas, es posible mantener células lejos del daño y obtener la mayor tasa de NSCs de cada animal.
Aquí, presentamos una técnica simple y reproducible para el aislamiento de las células madre neurales del cerebro de embriones de ratón E13 .
Protocol
Representative Results
Discussion
Utilizando una fuente adecuada de células madre neurales es muy importante para los neurólogos. Las células madre neurales podría cosecharse de diferentes áreas del cerebro embrionario y pueden generar tipos específicos de neuronas y células gliales. Existen varios métodos para la inducción de la diferenciación de las células madre neurales para inducirlos a generar neuronas maduras y células gliales. Hay numerosos informes que indican que bajo condiciones de cultivo específicas y regimientos de factor tróf…
開示
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por el Instituto Royan.
Materials
| 15 mL tubes | Falcon | 352097 | |
| 50 mL tubes | Falcon | 352235 | |
| Adson Forceps, 12 cm, Straight | WPI | 14226 | |
| B27 | Gibco | 17504-44 | |
| bFGF | Sigma | F0291 | |
| bovine serum albumin (BSA) | Sigma | A2153 | |
| dish 10cm | Falcon | 353003 | |
| Dressing Forceps, 12.5 cm, Straight | WPI | 15908 | |
| Dumont Tweezers, 11 cm, Straight | WPI | 500342 | |
| EGF | Sigma | E9644 | |
| Ethanol | Merck | 100983 | |
| Glutamate | Sigma | G3291 | |
| Glutamax | Gibco | 35050061 | |
| goat anti rabbit FITC conjugated secondary antibody | Sigma | AP307F | |
| goat serum | Sigma | G9023 | |
| Heparin | Sigma | h3149 | |
| HEPES | Sigma | 83264 | |
| HEPES | Sigma | 90909C | |
| insulinsyringe with 25-27 gauge Needle | SUPA medical | A1SNL127 | |
| laminin | sigma | L2020 | |
| MEM | Sigma | M2279 | |
| N2 supplement | Gibco | 17502048 | |
| NB medium | Gibco | 21103-31 | |
| Non-essential amino acid (NEAA) | Gibco | 11140050 | |
| PBS without Ca and Mg | Gibco | 20012050 | |
| Penicilin/ Streptomycin | Gibco | 5140122 | |
| Poly-L-ornithine | Sigma | P4957 | |
| rabbit anti mouse beta tubulin-III antibody | Sigma | T2200 | |
| rabbit anti mouse GFAP antibody | Sigma | G4546 | |
| rabbit anti mouse Nestin antibody | Sigma | N5413 | |
| Scalpel Handle #3 | WPI | 500236 | |
| Scissors curve | WPI | 14396 | |
| Scissors sharp straight | WPI | 14192 | |
| Soybean trypsin inhibitor | Roche | 10109886001 | |
| Tissue culture flasks, T25 | BD | 353014 | |
| Tissue culture flasks, T75 | BD | 353024 | |
| Tween 20 | Sigma | P1379 | |
| Vannas Scissors, 8 cm, Straight | WPI | 14003 | |
| β-mercaptoethanol | Sigma | M6250 |
参考文献
- Navarro Quiroz, E., et al. Cell Signaling in Neuronal Stem Cells. Cells. 7 (7), (2018).
- Choi, C. I., et al. The Thrombin Receptor Restricts Subventricular Zone Neural Stem Cell Expansion and Differentiation. Scientific Reports. 8 (1), 9360 (2018).
- Li, H., et al. Isolation of a novel rat neural progenitor clone that expresses Dlx family transcription factors and gives rise to functional GABAergic neurons in culture. Developmental Neurobiology. 72 (6), 805-820 (2012).
- Liu, Y., et al. Derivation of phenotypically diverse neural culture from hESC by combining adherent and dissociation methods. Journal of Neuroscience Methods. , (2018).
- Dhara, S. K., et al. Human neural progenitor cells derived from embryonic stem cells in feeder-free cultures. Differentiation. 76 (5), 454-464 (2008).
- Aligholi, H., Hassanzadeh, G., Gorji, A., Azari, H. A Novel Biopsy Method for Isolating Neural Stem Cells from the Subventricular Zone of the Adult Rat Brain for Autologous Transplantation in CNS Injuries. Methods in Molecular Biology. 1462, 711-731 (2016).
- Azari, H., Sharififar, S., Rahman, M., Ansari, S., Reynolds, B. A. Establishing embryonic mouse neural stem cell culture using the neurosphere assay. Journal of Visualized Experiments. (47), (2011).
- Ferrari, D., Binda, E., De Filippis, L., Vescovi, A. L. Isolation of neural stem cells from neural tissues using the neurosphere technique. Current Protocols in Stem Cell Biology. , (2010).
- Guo, W., Patzlaff, N. E., Jobe, E. M., Zhao, X. Isolation of multipotent neural stem or progenitor cells from both the dentate gyrus and subventricular zone of a single adult mouse. Nature Protocols. 7 (2012), (2005).
- Liu, P., et al. Passage Number is a Major Contributor to Genomic Structural Variations in Mouse iPSCs. Stem Cells and Development. 32 (10), 2657-2667 (2014).
- Diaferia, G. R., et al. Systematic Chromosomal Analysis of Cultured Mouse Neural Stem Cell Lines. Stem Cells and Development. 20 (8), 1411-1423 (2011).
- Hemmer, K., et al. Induced Neural Stem Cells Achieve Long-Term Survival and Functional Integration in the Adult Mouse Brain. Stem Cell Reports. 3 (3), 423-431 (2014).
- Menon, V., Thomas, R., Ghale, A. R., Reinhard, C., Pruszak, J. Flow Cytometry Protocols for Surface and Intracellular Antigen Analyses of Neural Cell Types. Journal of Visualized Experiments. (94), 52241 (2014).
- Zhang, Z., Wang, Z., Rui, W., Wu, S. Magnesium lithospermate B promotes proliferation and differentiation of neural stem cells in vitro and enhances neurogenesis in vivo. Tissue and Cell. 53, 8-14 (2018).
- Zilkha-Falb, R., Gurevich, M., Hanael, E., Achiron, A. Prickle1 as positive regulator of oligodendrocyte differentiation. 神経科学. 364, 107-121 (2017).
- Wang, L., et al. Oligodendrocyte differentiation from human neural stem cells: A novel role for c-Src. Neurochemistry International. 120, 21-32 (2018).
- Palanisamy, A., et al. Oxytocin alters cell fate selection of rat neural progenitor cells in vitro. PLoS ONE. 13 (1), e0191160 (2018).
- Llewellyn-Smith, I. J., Basbaum, A. I., Braz, J. M. Long-term, dynamic synaptic reorganization after GABAergic precursor cell transplantation into adult mouse spinal cord. Journal of Comparative Neurology. 526 (3), 480-495 (2018).
- Precious, S. V., et al. FoxP1 marks medium spiny neurons from precursors to maturity and is required for their differentiation. Experimental Neurology. 282, 9-18 (2016).
