Aquí, presentamos un protocolo para la preparación de rodajas de agarosa llena el pulmón humano de precisión de corte de tejido resecado paciente aptas para generar cultivos de tejido 3D pulmón enfermedades de pulmón humano modelo en estudios biológicos y biomédicos.
Traducción de nuevos descubrimientos en la enfermedad humana está limitada por la disponibilidad de modelos a base de tejido humanos de la enfermedad. Pulmón de precisión de corte rodajas (PCLS) usado como cultivos de tejidos de pulmón 3D (3D-LTCs) representan un elegante y modelo de célula 3D biológicamente muy relevantes de la cultura, que se asemejan a altamente tejido in situ debido a su complejidad, biomecánica y molecular composición. Corte de tejido se aplica ampliamente en varios modelos animales. 3D-LTCs derivadas PCLS humano pueden utilizarse para analizar las respuestas a fármacos nuevos, que además podrían ayudar a comprender mejor los mecanismos y efectos funcionales de los medicamentos en el tejido humano. La preparación de PCLS de muestras de tejido pulmonar resecado quirúrgicamente de los pacientes, que experimentaron el lobectomy pulmonar, aumenta la accesibilidad de los enfermos y el tejido peritumoral. Aquí, describimos un protocolo detallado para la generación de PCLS humana del tejido quirúrgico resecado suave elástico pulmonar paciente. Agarosa se introdujo en el espacio broncoalveolar de la resectates, así preservando la estructura del pulmón y aumentar la rigidez del tejido, que es crucial para el posterior corte. rodajas gruesas de 500 μm se prepararon desde el bloque de tejido con un vibratome. Punzones de biopsia tomadas de PCLS aseguran tejido comparable a tamaños de muestra y aumentan la cantidad de muestras de tejido. Las culturas de tejido pulmonar generado se puede aplicar en una variedad de estudios en Biología del pulmón humano, incluyendo la fisiopatología y los mecanismos de diferentes enfermedades, como procesos fibróticos en sus niveles celulares mejores (sub-). El mayor beneficio del LTC 3D vivo ex modelo es su representación cercana del pulmón humano in situ en tejido 3D arquitectura, diversidad de tipo celular y anatomía de pulmón así como el potencial para la evaluación del tejido de pacientes individuales, que es relevante desarrollar estrategias novedosas para la medicina de precisión.
Enfermedades pulmonares crónicas y agudas son una causa importante de morbilidad y mortalidad en todo el mundo1. Para los pacientes con enfermedades pulmonares crónicas como la enfermedad pulmonar obstructiva (EPOC)2, asma severa3, cáncer de pulmón4 y pulmonar parenquimal difusa enfermedades5, terapias curativas no están disponibles actualmente. Aunque los estudios en modelos animales para enfermedades pulmonares han profundizado la comprensión de los pathomechanisms de la enfermedad6 y han llevado a la identificación de potenciales dianas terapéuticas novela7,8,9, Estos modelos muestran diferencias biológicas y fisiológicas relevantes en comparación con los seres humanos10. Para superar estas discrepancias entre biología murina y humana así como anatomía humana ex vivo cultivo de tejidos de pulmón 3D (3D-LTC) sistemas se utilizan en diversas áreas de la investigación biomédica. Estos sistemas de cultivo 3D-LTC se basan en lonchas de pulmón de precisión de corte (PCLS). La generación de PCLS ex vivo permite el análisis de una tercera dimensión espacial, que permite la investigación de las relaciones espaciales y funcionales de las células en todo alvéolos y las vías respiratorias11, así como el intersticio, la vasculatura y mesotelio. En particular, PCLS ex vivo modelos son pluricelulares, lo que significa que contienen células más funcionales de los pulmones in situ, lo que representa cerca entorno biológico natural de las células y superando así la limitada célula-célula y célula-matriz de interacción en 2D más Acerca de la cultura de célula. Hasta ahora, ex vivo murinos PCLS fueron utilizados para modelar las enfermedades pulmonares, como EPOC12, pulmón fibrosis13, cáncer de pulmón14, infección viral15,16, displasia broncopulmonar17y asma18. Sin embargo, una proporción considerable de las terapias de fármaco nuevo en enfermedades de los pulmones humanos que se investigaron en los ensayos clínicos no se traducen a la clínica debido a su falta de eficacia o seguridad, presumible debido a todavía considerables diferencias entre humanos y murino biología y enfermedad19,20,21.
Durante varios años, PCLS humanas se han utilizado en gran medida para evaluar la toxicidad pulmonar de fármacos y productos químicos. Recientemente, se ha utilizado tejido pulmonar humano de pacientes con EPOC22,23asma24y25años fibrosis pulmonar, para perseguir estudios fisiopatológicos y farmacológicos. Por usar material de órganos de pacientes resecados y generando PCLS, uno puede recapitulan las características principales de la enfermedad en un complejo tejido 3D medio ambiente22 representar y mantener la mayor parte de la diversidad celular nativa del órgano. Por otra parte, tejido enfermo aplicado en una variedad de configuraciones experimentales se demostró que mímico enfermedad-como cambios en el hígado, intestino y riñón26,27,28,29.
Sin embargo, procesamiento del tejido pulmonar sigue siendo un reto por varias razones. A diferencia de los tejidos sólidos, parenquimia de pulmón nativo tiende a colapsar sin ventilación y exhibe la menor rigidez del tejido. Estas propiedades impiden el corte del tejido. Así, relleno de vías aéreas y el espacio alveolar con bajo punto de fusión punto de agarosa mantiene la estructura del pulmón nativo y proporciona la rigidez necesaria para la precisión de corte de corte de los pulmones murinos y humanos30. Resectates de pulmón humano donados para fines de investigación son por su naturaleza anatómica, genética y fisiológicamente muy diversa, a menudo presentando así una elevada variabilidad entre paciente al realizar experimentos25. En contraste con el lóbulo entero o explantes de pulmón entero, muestras de pulmón resecadas mediante cirugía torácica no necesariamente seguir los segmentos anatómicos y, por lo tanto, requieren de una preparación especial. En este artículo, nos proporcionan un protocolo detallado y optimizado para la generación de PCLS humano de tejido pulmonar resecado y su posterior cultivo y uso experimental para la enfermedad pulmonar modelo.
El protocolo descrito en este manuscrito cubre la generación de PCLS de resectates de tejido de pulmón humano llenando con agarosa líquida y posterior vibratome corte. Generación de rebanadas de tejido fue demostrado antes de un par de órganos, como hígado y cerebro, mientras que la rigidez inherente de estos órganos permite directa de corte sin ninguna modificación de los tejidos. A destacar la preparación inicial adecuada del tejido pulmonar es el paso más crucial en la generación de PCLS. Relleno de la agarosa del pulmón es el método de elección para estabilizar su naturaleza suave y elástico y para asegurar una generación de PCLS homogénea y reproducible. Vías aéreas grandes del tejido pulmonar resecado son canuladas para proporcionar acceso a las vías respiratorias pequeñas, así como a la parenquimia de pulmón intacto. La falta de una pleura intacta, que hace casi imposible el agarosa relleno, es una razón importante por qué tejido pulmonar es sobre todo útil para rebanar de pulmón. Anticipado, una pleura sintético diseñado originalmente para llevar a cabo experimentos funcionales sobre andamios decellularized potencialmente podría aplicarse para lograr el éxito agarosa relleno de explantes que carecen de una pleura intacta31. Resecciones en un pedazo de tejido de pulmón humano con pleura intacta son esenciales para la generación de bloques de tejido para cortar. Tejido resecado está más disponible debido al tejido de tumor-libre de resecciones de cáncer de lóbulos intactas o explantes pulmonar total de pacientes sometidos a trasplante de pulmón.
Comúnmente, se utilizan dos sistemas para producir PCLS: Krumdieck tejido cortar15 los Micrótomos vibratorios (vibratomes). Cortadoras de tejido generan sectores atravesando un bloque de tejido de un recipiente del metal, que corta la PCLS en 90° al final de este buque. Vibratomes generar PCLS moviendo un vibrante cuchillo horizontalmente sobre un bloque de anclado del tejido que está sumergido en un baño medio refrigerado, que comparado con la máquina de cortar Krumdieck ejerce menos fuerza sobre el tejido. Esto resulta en menos severo tratamiento del tejido antes de cultivo. Por otro lado, el corte de vibratome es más tiempo y consumiendo trabajo. En nuestras manos, vibratome corte permitió la producción de un máximo de 100 PCLS o 500 PCLS golpes en un día, suficiente para estudios más experimentales. PCLS puede cultivarse en diversas formas: (a) al Trans-wells, generando una interfaz líquido aire sistema (ALI), (b) como cultivo dinámico (DOC), o (c) sumergido en medio de cultivo celular en condiciones de cultivo de célula estándar. El cultivo en detalle del PCLS fue descrita22,23,25; sin embargo, un estándar común de las condiciones de cultivo entre su uso en varios laboratorios alrededor del mundo está todavía ausente. En particular, el tiempo de la cultura podría ser crítico: como en murinos PCLS, se observa una pérdida de células de tipo alveolar positiva 2 SFTPC después de 144 h, pero no después de 120 h22. Además, actividad metabólica parece permanecer estable en murinos22 y humano PCLS25 de 120 h.
Hay un par de limitaciones técnicas para la generación de PCLS: el número y tamaño de la resectates fluctúa en el tiempo. la eficiencia de la agarosa de relleno, que depende de la presencia de pleura intacta dentro del tejido obtenido, determina el éxito final de la generación del PCLS; y destrucción del tejido causada por cambios patológicos en el tejido pulmonar (enfermo) obtenidos podría interferir con la preparación del PCLS. Obstrucciones de la vía aérea y tejido fibrótico que carecen de espacio alveolar intacta impiden con agarosa al relleno y así hacen una exigente tarea de corte de tejido fibrótico. Enfisematosos tejidos como encontraron en enfermedades como EPOC o deficiencia de alfa-1-anti-tripsina podría no soportar la presión de llenado de agarosa y resultará en ruptura de los alvéolos y objetos arquitectónicos. En estos casos, el uso de agarosa baja concentración, por ejemplo,, 1% (p/v), podría ser útil para disminuir la presión y la velocidad durante el llenado de la agarosa. En general, el estado de enfermedad del tejido puede limitar drásticamente el uso del tejido para la generación de PCLS. Todos estos parámetros determinan la cantidad de PCLS que puede generarse a partir de tejido pulmonar, y también la cantidad de tiempo que se necesita para producir la PCLS. Otras limitaciones del PCLS son inconsistencias entre lonchas de pulmón diferentes con respecto a contenido tamaño o tejido, que requiere más pasos de normalización para los experimentos. Para superar esto, se pueden generar Punzones de biopsia de regiones similares del mismo segmento. Este procedimiento es apto para reducir la variabilidad del tejido y, como beneficio adicional, aumentar el número de muestras PCLS que puede ser utilizado para experimentos.
En conclusión, lleno de cultivos de tejido de pulmón humano 3D de agarosa PCLS proporcionan un modelo humano complejo para estudiar la fisiología del pulmón y las enfermedades. El protocolo proporciona una descripción detallada de la preparación de PCLS de tejido pulmonar resecado y su cultivo y además enfrenta los desafíos en el relleno de la agarosa de resecciones de pulmón humano y cómo superarlos.
The authors have nothing to disclose.
Los autores agradecemos a Marisa Neumann experta asistencia técnica. Todos los tejidos del pulmón fueron amablemente proporcionados por el CPC-M Bio-archivo. Este trabajo fue apoyado por el centro alemán de investigación del pulmón (DZL), la Asociación Helmholtz y CPC investigación escuela subvenciones.
Vibratome Hyrax V50 | Zeiss | – | |
Hyrax CU 65 | Zeiss | – | |
Vasofix Braunüle 18G | B. Braun Melsungen AG | 4268130B | |
30mL NORM-INJECT | Henke Sass Wolf | 4830001000 | |
Guarded disposable scalpels, sterile | Swann-Morton | ||
Loctite 406 | Henkel | LOCTITE 406 | |
Synthetic Single Crystal Sapphire | Delaware Diamond Knives | – | |
Dulbecco's Modified Eagle Medium F-12 Nutreient Mixture (Ham) + L-Glutamine + 15mM HEPES | Gibco | 31330-038 | |
Penicillin Streptomycin | Gibco by Life Technologies | 15070-063 | |
Special process fetal bovine serum (Sera Plus) | Pan Biotech | P30-3702 | |
Disposable Biopsy Punch | pfm medical | 48401 | |
96 Well, Black/Clear, Tissue Culture Treated Plate, Flat Bottom with Lid, sterile | Falcon / Corning | 353219 | |
Agarose, low geling temperature | Sigma | A9414-100G |