כאן, אנו מציגים פרוטוקול להכנת פרוסות מלא agarose דיוק-קאט אמבריולוגיה מרקמות החולה resected המתאימים ליצירת ריאות 3D בתרביות רקמה למחלות ריאה אנושיים מודל במחקרים ביולוגי וביו.
תרגום של תגליות הרומן למחלה האדם מוגבל בשל הזמינות של האנושי רקמות מבוססי מודלים של המחלה. ריאות דיוק-לחתוך פרוסות (PCLS) משמש בתרביות רקמה בריאה תלת-ממד (3D-LTCs) מייצגים אלגנטי ומודל תא 3D ביולוגית מאוד רלוונטי תרבות, אשר דומה מאוד רקמות באתרו עקב המורכבות שלהם, ביומכניקה ומולקולרית ההרכב. רקמות לחתוך מוחל נרחב במודלים של בעלי חיים שונים. 3D-LTCs נגזר PCLS האנושי יכול לשמש כדי לנתח את התגובות תרופות חדישות, שעשויה לסייע עוד יותר כדי להבין טוב יותר את מנגנוני ואת תפקודית השפעות הסמים על רקמה אנושית. הכנת PCLS מדגימות רקמת ריאה בניתוח resected של חולים, אשר חוו כריתת ריאה, מגדילה את הנגישות של חולה ואת רקמות peritumoral. כאן, אנו מתארים את פרוטוקול מפורט לדור של האדם PCLS של רקמת הריאה החולה בניתוח resected אלסטי רך. Agarose הוצג לתוך מרחב bronchoalveolar של resectates, ולכן שמירה על מבנה הריאות והגברת הנוקשות של הרקמה, אשר חיוני שמגיע עוקבות. 500 פרוסות עבות מיקרומטר הוכנו מהגוש רקמות עם vibratome. הביופסיה שנלקחו PCLS להבטיח רקמה דומה גודל מדגם ומכשירים להמשיך להגדיל את כמות דגימות רקמה. התרבויות רקמת הריאות שנוצר יכול להיות מיושם במגוון לימודי בביולוגיה אמבריולוגיה, כולל פתופיזיולוגיה, מנגנונים של מחלות שונות, כגון תהליכים שהותירה ברמות הסלולר שלה הכי טוב (נולד ב- sub). היתרון הגבוהה של הדגם ex-vivo 3D-LTC הוא הייצוג שלו קרוב של הריאה האנושי באתרו בגין אדריכלות רקמות תלת-ממד, גיוון סוג התא, ריאות אנטומיה, כמו גם את הפוטנציאל עבור הערכה של רקמות מחולים בודדים, אשר רלוונטי להמשיך ולפתח אסטרטגיות מקוריות עבור דיוק רפואה.
מחלות ריאה כרונית וחמורה הן הגורם העיקרי של התחלואה והתמותה ברחבי העולם1. עבור חולים עם מחלות ריאה כרוניות כמו מחלת ריאות חסימתית (COPD)2, אסטמה חמורה3, סרטן ריאות4 מחלות ריאה parenchymal ‘ מאטום לשקוף ‘5, טיפולים המרפא כיום אינם זמינים. למרות מחקרים במודלים של בעלי חיים למחלות ריאה יש העמיקה את ההבנה של מחלת pathomechanisms6 , הובילו הזיהוי של פוטנציאל מטרות טיפולית הרומן7,8,9, מודלים אלה מציגים הבדלים ביולוגי, פיזיולוגיים רלוונטי בהשוואה בני10. כדי להתגבר על אלו אי-התאמות בין ביולוגיה מאתר ואנושי, כמו גם אנטומיה, אנושי ex-vivo תרביות רקמה בריאה תלת-ממד (3D-LTC) מערכות משמשים במגוון תחומי המחקר הביו-רפואי. מערכות התרבות 3D-LTC אלה מבוססים על ריאות דיוק-לחתוך פרוסות (PCLS). הדור של PCLS ex-vivo מאפשר ניתוח של dimensionality המרחבי השלישי, אשר מאפשר חקירה של קשרי הגומלין המרחבי פונקציונלי של תאים כולו alveoli ו איירווייז11, כמו גם interstitium, להערכת ו mesothelium. ראוי לציין, PCLS ex-vivo מודלים הם multicellular, כלומר שהם מכילים תאים הכי פונקציונלי של הריאות באתרו, ובכך מקרוב המייצג התאים לסביבתם הטבעית הביולוגית, ובכך להתגבר על התא מוגבל-תא ואינטראקציה תא מטריצה ב 2D רוב תרבית תאים מתקרב. עד עכשיו, שמחוץ PCLS מאתר שימשו להדגמת מחלות ריאות, כמו COPD12, פיברוזיס של הריאה13, סרטן ריאות14, זיהום נגיפי15,16, דיספלסיה bronchopulmonary17, ו 18. עם זאת, שיעור ניכר של טיפולים תרופתיים חדשניים במחלות ריאות אנושי זה נחקרו בניסויים קליניים לא לתרגם למרפאה עקב חוסר יעילות או בטיחות, assumingly בשל עדיין ניכר הבדלים בין בני האדם, מאתר ביולוגיה ומחלות19,20,21.
על פני מספר שנים, PCLS האנושי שימשו בעיקר כדי להעריך את הריאות רעילות של כימיקלים וסמים. רק לאחרונה, רקמת הריאה האנושי שימש מחולים עם22,23COPD, אסטמה24ו פיברוזיס של הריאה25, לרדוף אחר מחקרים הקשורים pathophysiological תרופתי. על ידי שימוש בחומר resected האיבר החולה, הפקת PCLS הימנו, אחד יכול לסכם המחפשים המחלה העיקריים רקמות תלת-ממדיים מורכבים הסביבה22 ייצוג ושמירה על רוב המגוון הסלולר מקורית של האיבר. יתר על כן, רקמות חולות מיושם במגוון setups ניסיוני הוצגה לחקות שינויים, כמו מחלת כבד, מעיים וכליות26,27,28,29.
עם זאת, העיבוד של רקמת הריאה נותר מאתגר מכמה סיבות. בניגוד רקמה מוצק, parenchyma הריאה יליד נוטה ללא אוורור ותערוכות התחתון רקמות קשיחות. מאפיינים אלה לעכב את חיתוך של הרקמה. לפיכך, מילוי של דרכי הנשימה ואת הרווח מכתשי עם agarose נקודת התכה נמוכה משמר את מבנה הריאות מקורית ומספקת הקשיחות הדרושה דיוק-קאט לחתוך של הריאות מאתר ואנושי30. Resectates אמבריולוגיה שנתרמו למטרות מחקר הן על ידי הטבע שלהם מבחינה אנטומית, גנטית, מבחינה פיזיולוגית מאוד מגוונת, לכן לעיתים קרובות הצגת השתנות גבוהה בין המטופל בעת ביצוע ניסויים25. בניגוד כל האונה או explants כל הריאה, ריאות resected על-ידי ניתוח החזה לא בהכרח בצע את מקטעי אנטומי ודוגמאות, לכן, דורשים הכנה מיוחדת. במאמר זה, אנו מספקים פרוטוקול מפורט וממוטב לדור של האדם PCLS של רקמת הריאה resected ושלהם עוקבות הטיפוח-תרגול שימוש ניסיוני למחלות ריאה מודל.
הפרוטוקול המתואר בכתב יד זה מכסה את הדור של PCLS מאמבריולוגיה רקמת resectates על-ידי ממלא אותו עם agarose נוזלי וחלוקת vibratome הבאים. דור של רקמות פרוסות הודגם לפני כמה איברים, כמו הכבד והמוח, ואילו הנוקשות הטבועה של איברים אלה מותר ישירה עם פרוסות ללא כל שינוי של הרקמה. ראוי לציין, הכנה נאותה הראשונית של רקמת הריאה הוא הצעד המכריע ביותר ביצירת PCLS. מילוי Agarose של הריאה היא השיטה של בחירה כדי לייצב את טבעה רך וגמיש, ולהבטיח דור PCLS הומוגנית, לשחזור. דרכי הנשימה גדול של רקמת הריאה resected הם לצינוריות כדי לספק גישה קטנות, כמו גם אל parenchyma הריאה ללא פגע. חוסר קרום הריאות תקין, מה שהופך agarose מילוי כמעט בלתי אפשרי, היא הסיבה הראשית למה רקמת הריאה הוא בעיקר לא שמיש ריאות שמגיע. פרוספקטיבי, קרום הריאות סינתטי תוכנן במקור כדי לבצע ניסויים פונקציונלי על פיגומים decellularized יכול לחול באופן פוטנציאלי כדי להשיג מילוי agarose מוצלחת של explants חסרי קרום הריאות תקין של31. כריתות וכתוצאה מכך חתיכת רקמת ריאה אנושיים עם קרום הריאות תקין חיוניים ליצירת רקמות בלוקים שמגיע. רקמת resected זמין יותר בשל רקמת הגידול ללא סרטן כריתות מאשר אונות שלם מלא או כל-לונג explants של חולים שעברו השתלת ריאה.
בדרך כלל, שתי מערכות משמשות כדי לייצר PCLS: Krumdieck רקמות מבצעה15 ומיקרוטומים רטט (vibratomes). רקמות slicers ליצור פרוסות על-ידי העברת גוש רקמה באמצעות כלי מתכת, אשר חותך את PCLS ב- 90° בקצה של כלי השיט הזה. Vibratomes צור PCLS על-ידי הזזת רוטטת הסכין אופקית מעל בלוק המעוגן של רקמת בתוך אמבט בינוני מקורר, אשר לעומת בפורס Krumdieck מפעילה פחות כוח הטיה על הרקמה. התוצאה פחות היחס הקשה של הרקמה לפני התרגול. מצד שני, חיתוך vibratome הוא יותר זמן עבודה רב. בידיים שלנו, vibratome חותך הזמינים הייצור של מקסימום של 100 PCLS או 500 PCLS אגרופים ביום אחד, מספיק ללימודי האקספרימנטאלי ביותר. PCLS יכול להיות תרבותי במגוון דרכים: (א) אלו טרנס-וולס, ובכך יצירת ממשק נוזלי אוויר מערכת (עלי), (ב) כתרבות איבר דינאמי (DOC), או (ג) שקוע בתוך תא בינוני תרבות-תנאי התרבות תא סטנדרטי. הטיפוח בפירוט של PCLS היה שתואר לעיל22,23,25; אולם, תקן נפוץ של טיפוח תנאים בין השימוש שלהם במעבדות שונות ברחבי העולם היא עדיין נעדרת. בפרט, הזמן תרבות עשוי להיות קריטי: כמו מאתר PCLS, הפסד של SFTPC חיובי מכתשי מסוג 2 תאים נצפית לאחר 144 h, אבל לא אחרי 120 h22. בנוסף, פעילות חילוף החומרים נראה נותרים יציבים מאתר22 , PCLS האנושי25 עבור 120 h.
ישנן כמה מגבלות טכניות עבור הדור של PCLS: המספר והגודל של resectates תנודות לאורך זמן; היעילות של agarose מילוי, אשר תלוי הנוכחות של קרום הריאות תקין בתוך רקמת שהושג, קובע הסופי ההצלחה של הדור PCLS; הרס רקמות הנגרמת על ידי שינויים פתולוגיים בתוך רקמת הריאה (חולה) שהושג עשויים להפריע ההכנה PCLS. חסימות דרכי הנשימה רקמות שהותירה חסר שטח מכתשי שלם לעכב עם agarose מילוי, ובכך להפוך חיתוך של הרקמה שהותירה משימה תובענית. Emphysematous רקמות כמו למצוא מחלות כגון COPD או אלפא-1-אנטי-טריפסין לקוי עלול שלא עמדו בלחץ של agarose מילוי, יגרום קרע של alveoli ושל חפצי אדריכלי. במקרים אלה, השימוש של ריכוז agarose נמוך, למשל, 1% (w/v), עשוי להיות שימושי להקטין את הלחץ ומהירות במילוי agarose בסך הכל, המדינה מחלה של הרקמות באופן דרמטי יכול להגביל את השימוש הרקמה לדור PCLS. כל הפרמטרים הללו קובעים את כמות PCLS זה ניתן להפיק של רקמת הריאה, גם משך הזמן שנדרש כדי לייצר את PCLS. יותר מגבלות של PCLS הם חוסר עקביות בין פרוסות הריאות שונה לגבי תוכן גודל או רקמות, אשר דורש צעדים נורמליזציה לניסויים. כדי להתגבר על זה, אגרופים ביופסיה של אזורים דומים של הפרוסה אותה ניתן להפיק. ההליך זה מתאים להפחית את מידת ההשתנות רקמות, בתור יתרון נוסף, להגדיל את מספר דוגמאות PCLS יכול לשמש לניסויים.
לסיכום, אמבריולוגיה 3D בתרביות רקמה מן agarose מלא PCLS לספק מודל אנושי מורכב עבור לימודי פיזיולוגיה ריאות ומחלות. הפרוטוקול מספק תיאור מפורט של הכנת PCLS של רקמת הריאה resected, הטיפוח-תרגול, יתר על כן מטפל אתגרים agarose מילוי של אמבריולוגיה כריתות וכיצד להתגבר עליהם.
The authors have nothing to disclose.
המחברים מודים לנוימן מריסה לסיוע טכני מומחה. לכל רקמות הריאה היו מתבקשים שסופקו על-ידי עלות לקליק-M ביו-ארכיון. עבודה זו נתמכה על ידי המרכז הגרמנית של מענקי מחקר הריאות (DZL), הלמהולץ האגודה עלות לקליק מחקר בבית הספר.
Vibratome Hyrax V50 | Zeiss | – | |
Hyrax CU 65 | Zeiss | – | |
Vasofix Braunüle 18G | B. Braun Melsungen AG | 4268130B | |
30mL NORM-INJECT | Henke Sass Wolf | 4830001000 | |
Guarded disposable scalpels, sterile | Swann-Morton | ||
Loctite 406 | Henkel | LOCTITE 406 | |
Synthetic Single Crystal Sapphire | Delaware Diamond Knives | – | |
Dulbecco's Modified Eagle Medium F-12 Nutreient Mixture (Ham) + L-Glutamine + 15mM HEPES | Gibco | 31330-038 | |
Penicillin Streptomycin | Gibco by Life Technologies | 15070-063 | |
Special process fetal bovine serum (Sera Plus) | Pan Biotech | P30-3702 | |
Disposable Biopsy Punch | pfm medical | 48401 | |
96 Well, Black/Clear, Tissue Culture Treated Plate, Flat Bottom with Lid, sterile | Falcon / Corning | 353219 | |
Agarose, low geling temperature | Sigma | A9414-100G |