Hier präsentieren wir Ihnen ein Protokoll für die Vorbereitung der Agarose-gefüllte menschlichen präzise geschliffenen Lunge Scheiben aus resezierten Patienten Gewebe, die für die Erzeugung von 3D Lunge Gewebekulturen, Modell menschlichen Lungenerkrankungen in biologischen und biomedizinischen Studien eignen.
Übersetzung der neuartigen Entdeckungen menschlicher Erkrankungen wird durch die Verfügbarkeit von menschlichen Gewebe-basierte Modelle der Krankheit begrenzt. Präzise geschliffenen Lunge Scheiben (PCLS) verwendet, da 3D Lunge Gewebekulturen (3D-LTCs) ein elegantes darstellen und biologisch hochrelevant 3D Kultur Zellmodell, die stark ähneln in-situ Gewebe aufgrund ihrer Komplexität, Biomechanik und molekulare Zusammensetzung. Gewebe zu schneiden ist in verschiedenen Tiermodellen eingesetzt. 3D-LTCs abgeleitet von menschlichen PCLS können verwendet werden, um Antworten auf neue Medikamente, zu analysieren, die weiter, zum besseren Verständnis der Mechanismen und funktionellen Auswirkungen von Drogen im menschlichen Gewebe helfen könnte. Die Vorbereitung des PCLS von chirurgisch reseziertem Lunge Gewebeproben von Patienten, die Lunge Lobektomie erlebt, erhöht die Zugänglichkeit der erkrankten und peritumorale Gewebe. Hier beschreiben wir ein detailliertes Protokoll für die Erzeugung von menschlichen PCLS von chirurgisch reseziertem weich-elastisch Patienten Lungengewebe. Agarose wurde in den alvéolaire Raum der Resectates eingeführt, so Lunge Struktur erhalten und steigern das Gewebe Steifigkeit, die entscheidend für das spätere schneiden. 500 µm dicke Scheiben wurden aus dem Gewebe-Block mit einem Vibratome vorbereitet. Biopsie-Stanzen entnommen PCLS sorgen für vergleichbare Gewebe Stichprobengrößen und weiter erhöhen Sie die Menge von Gewebeproben. Die generierten Lunge Gewebekulturen können in einer Vielzahl von Studien in der menschlichen Lunge Biologie, einschließlich der Pathophysiologie und Mechanismen von verschiedenen Krankheiten, wie z. B. fibrotischen Prozesse am besten bei (Sub-) zellulären Ebene angewendet werden. Der größten Nutzen von 3D-LTC ex Vivo Modell ist seine enge Darstellung der in-situ menschlichen Lunge in Bezug auf 3D Gewebearchitektur, Zelle Typenvielfalt und Lunge Anatomie sowie das Potenzial für die Beurteilung des Gewebes von einzelnen Patienten, die ist relevant für die weitere Entwicklung neuer Strategien für Präzisionsmedizin.
Akuten und chronischen Lungenerkrankungen sind eine der Hauptursachen für Morbidität und Mortalität weltweit1. Für Patienten mit chronischen Lungenerkrankungen wie obstruktiver Lungenerkrankung (COPD)2, schwerem Asthma3, Lunge Krebs4 und diffuse parenchymal Lung Krankheiten5sind kurative Therapien derzeit nicht verfügbar. Obwohl Studien in Tiermodellen für Lungenerkrankungen sich das Verständnis der Krankheit Pathomechanismen6 vertieft haben und zur Identifizierung von potenziellen neue therapeutische Targets7,8,9 führten, Diese Modelle weisen relevanten biologischen und physiologischen Unterschiede im Vergleich zu Menschen10. Um diese Diskrepanzen zwischen den murinen und menschliche Biologie und Anatomie, menschliche ex Vivo 3D Lunge Gewebekultur überwunden werden (3D-LTC) Systeme in verschiedenen Bereichen der biomedizinischen Forschung eingesetzt. Diese 3D-LTC-Kultur-Systeme basieren auf Precision-Cut Lung Slices (PCLS). Die Generation der PCLS ex Vivo ermöglicht die Analyse der eine dritte räumliche Dimensionalität, die für die Untersuchung der räumlichen und funktionalen Beziehungen der Zellen im gesamten Alveolen und Airways11, sowie das Interstitium, Gefäßsystem ermöglicht und Mesothel. Insbesondere sind PCLS ex-Vivo-Modelle mehrzelligen, was bedeutet, dass sie funktionellste Zellen in-situ Lungen enthalten, stellvertretend für die Zellen native biologischen Umgebung eng und damit Überwindung der begrenzten Zell-Zell und der Zellmatrix Interaktion in den meisten 2D Zellkultur nähert. Bis jetzt ex Vivo murinen PCLS dienten, Lungenerkrankungen, wie COPD12, Lungen-Fibrose-13, Lunge Krebs14, Virusinfektion15,16, bronchopulmonale Dysplasie17, zu modellieren und Asthma-18. Jedoch ein erheblicher Teil der neuartige medikamentöse Therapien bei menschlichen Lungenerkrankungen, die in klinischen Studien untersucht wurden nicht übersetzen in die Klinik aufgrund ihrer mangelnden Wirksamkeit oder Sicherheit, assumingly wegen noch erhebliche Unterschiede zwischen Mensch und murine Biologie und Krankheit19,20,21.
Über mehrere Jahre hinweg wurden menschliche PCLS weitgehend zur Lunge Toxizität von Chemikalien und Drogen zu beurteilen. Erst vor kurzem wurde menschliche Lungengewebe von Patienten mit COPD22,23, Asthma24und Lunge Fibrose25, zur pathophysiologische und pharmakologische Studien nachzugehen. Durch Verwendung resezierten Patienten Orgel Materialien und generieren PCLS davon, kann eine schwere Erkrankung Markenzeichen in einem komplexen 3D Gewebe Umwelt22 Vertretung und Wahrung der native zellulären Vielfalt der Orgel zu rekapitulieren. Darüber hinaus zeigte sich erkranktes Gewebe angewendet in einer Vielzahl von Versuchsaufbauten, Krankheit-ähnliche Veränderungen in Leber, Darm und Nieren26,27,28,29zu imitieren.
Verarbeitung von Lungengewebe bleibt jedoch aus mehreren Gründen schwierig. Im Gegensatz zu festen Gewebe native Lungenparenchym tendenziell ohne Lüftung zusammenbrechen und unteren Gewebe Steifigkeit aufweist. Diese Eigenschaften erschweren die Schneiden des Gewebes. So Füllung der Atemwege und der alveoläre Raum mit niedrigschmelzenden Punkt Agarose bewahrt die native Lunge-Struktur und die Steifigkeit für präzise geschliffenen Schneiden von murinen und menschliche Lunge30benötigt. Menschlichen Lunge Resectates für Forschungszwecke gespendet sind von Natur aus anatomisch, genetisch und physiologisch sehr vielfältig, so oft präsentiert eine hohe Variabilität auf Inter Patienten bei der Durchführung von Experimenten25. Im Gegensatz zu den ganzen Lappen oder ganze Lunge Explantaten Lunge Proben mittels Thoraxchirurgie reseziert nicht unbedingt folgen die anatomische Segmente und erfordern daher besondere Vorbereitung. In diesem Artikel stellen wir eine detaillierte und optimierte Protokoll für die Erzeugung von menschlichen PCLS von resezierten Lungengewebe und ihren späteren Anbau und Versuchszwecke zu Modell Lungenerkrankung.
Das Protokoll in diesem Manuskript beschrieben gilt die Generation des PCLS von menschlichen Lunge Gewebe Resectates durch füllen mit flüssige Agarose und anschließende Vibratome schneiden. Generation von Gewebe Scheiben zeigte sich vor für ein paar von Organen, wie Leber und Gehirn, während die Eigensteifigkeit dieser Organe direkt schneiden ohne Änderung des Gewebes erlaubt. Der Hinweis ist der erste richtige Vorbereitung des Lungengewebes der wichtigste Schritt bei der Schaffung von PCLS. Agarose-Füllung der Lunge ist die Methode der Wahl, naturgemäß weich und elastisch zu stabilisieren und zu eine homogenere und reproduzierbare PCLS Generation zu gewährleisten. Großen Fluglinien des resezierten Lungengewebes sind für den Zugriff auf die kleinen Atemwege sowie auf die intakte Lungenparenchym kanülierte. Der Mangel an eine intakte Pleura, der Agarose füllen fast unmöglich macht, ist ein Hauptgrund, warum Lungengewebe meist nicht brauchbar für das Schneiden von Lungenkrebs ist. Prospektiv, konnte eine synthetische Pleura, ursprünglich entworfen, um funktionelle Experimente auf decellularized Gerüsten potenziell angewendet werden, um erfolgreiche Agarose Füllung von Explantaten zu erreichen, die eine intakte Pleura31fehlt. Resektionen, was zu einer menschlichen Lunge Gewebe Stück mit intakten Pleura sind wesentlich für die Erzeugung von Gewebe Blöcke zum Schneiden. Resezierten Gewebes gibt es mehr durch Tumor-freien Gewebe vom Krebs Resektionen als völlig intakt Lappen oder ganze Lunge Explantaten von Patienten, die Lungen-Transplantation unterzogen.
Allgemein, zwei Systeme werden verwendet, um PCLS zu produzieren: Krumdieck Gewebe Allesschneider15 und Vibrations Mikrotome (Vibratomes). Gewebe-Schneidemaschinen generieren Scheiben indem man einen Gewebe-Block durch einen Metallbehälter, welche die PCLS im 90 °-Winkel am Ende dieses Schiff schneidet. Vibratomes generieren PCLS durch Verschieben einer schwingenden Messer waagerecht über eine verankerte Block von Gewebe, das in einem gekühlten mittlere Bad eingetaucht ist, die im Vergleich zu den Krumdieck Allesschneider weniger Querkraft auf das Gewebe ausübt. Dies führt zu weniger harte Behandlung des Gewebes vor Anbau. Auf der anderen Seite ist das Vibratome schneiden mehr Zeit und Arbeit zu konsumieren. In unseren Händen schlägt Vibratome schneiden aktiviert die Produktion von maximal 100 PCLS oder 500 PCLS an einem Tag, ausreichend für die meisten experimentellen Untersuchungen. PCLS kann auf verschiedene Weise gezüchtet werden: (a) befestigt, Trans-Brunnen, wodurch eine flüssige Luftschnittstelle (ALI) System, (b) als dynamisches Organ Kultur (DOC), oder (c) eingetaucht in Zellkulturmedium bei Standardzelle Kulturbedingungen. Der Anbau im Detail des PCLS war zuvor beschriebenen22,23,25; Allerdings fehlt noch ein gemeinsamer Standard Anbaubedingungen zwischen deren Nutzung in verschiedenen Labors auf der ganzen Welt. Insbesondere die Kulturzeit kritisch sein könnte: wie in murinen PCLS wird ein Verlust von SFTPC positive alveolären Typ 2 Zellen beobachtet nach 144 h, aber nicht nach 120 h22. Darüber hinaus scheint die Stoffwechselaktivität in murinen22 und menschlichen PCLS25 für 120 h stabil bleiben.
Es gibt ein paar technische Beschränkungen für die Generation des PCLS: die Anzahl und Größe der Resectates schwankt im Laufe der Zeit; die Effizienz der Agarose füllen, die das Vorhandensein von intakten Pleura innerhalb des gewonnenen Gewebes abhängt, entscheidet über den endgültigen Erfolg der PCLS Generation; und Gewebezerstörung verursacht durch pathologische Veränderungen in der erhaltenen (Kranken) Lungengewebe PCLS Vorbereitung stören könnte. Atemwege Hindernisse und fibrotische Gewebe intakt alveoläre Raum fehlt mit Agarose Füllung behindern und damit Schneiden des fibrotischen Gewebes eine anspruchsvolle Aufgabe. Emphysematöse Gewebe als gefunden bei Erkrankungen wie COPD oder Alpha-1-Anti-Trypsin-Mangel könnte nicht widerstehen dem Druck der Agarose füllen, und zum Bruch der Alveolen und architektonischen Artefakten führt. In diesen Fällen kann die Verwendung von niedrigen Agarose Konzentration, z. B., 1 % (w/V), verringern Druck und Geschwindigkeit während des Füllens der Agarose nützlich sein. Insgesamt kann den Krankheitszustand des Gewebes die Verwendung des Gewebes für PCLS Generation drastisch einschränken. All diese Parameter bestimmen die Höhe des PCLS, die aus Lungengewebe generiert werden können, und auch die Menge an Zeit, die es braucht, um die PCLS zu produzieren. Weitere sind Einschränkungen des PCLS Inkonsistenzen zwischen verschiedenen Lunge Scheiben in Bezug auf Größe oder Gewebe Inhalt, wonach weitere Normalisierung Schritte für Experimente. Um dies zu überwinden, können Biopsie Schläge von vergleichbaren Regionen der gleichen Schicht erzeugt werden. Dieses Verfahren ist geeignet, reduzieren die Gewebe-Variabilität und als Zusatznutzen, erhöhen Sie die Anzahl der PCLS Proben, die für Experimente verwendet werden kann.
Zusammenfassend, menschlichen 3D Lunge Gewebekulturen von Agarose gefüllt PCLS vorsehen, dass ein komplexes Modell der menschlichen Lunge Physiologie und Krankheiten zu studieren. Das Protokoll enthält eine ausführliche Beschreibung der Vorbereitung des PCLS von resezierten Lungengewebe und deren Anbau und darüber hinaus befasst sich mit Herausforderungen in Agarose Füllung der menschlichen Lunge Resektionen und wie man sie überwinden.
The authors have nothing to disclose.
Die Autoren sind dankbar, Marisa Neumann für kompetente technische Unterstützung. Alle Lungengewebe wurden uns freundlicherweise zur Verfügung gestellt durch des CPC-M Bio-Archivs. Diese Arbeit wurde vom Deutschen Zentrum der Lunge Forschung (DZL), der Helmholtz-Gemeinschaft und CPC Research School Stipendien unterstützt.
Vibratome Hyrax V50 | Zeiss | – | |
Hyrax CU 65 | Zeiss | – | |
Vasofix Braunüle 18G | B. Braun Melsungen AG | 4268130B | |
30mL NORM-INJECT | Henke Sass Wolf | 4830001000 | |
Guarded disposable scalpels, sterile | Swann-Morton | ||
Loctite 406 | Henkel | LOCTITE 406 | |
Synthetic Single Crystal Sapphire | Delaware Diamond Knives | – | |
Dulbecco's Modified Eagle Medium F-12 Nutreient Mixture (Ham) + L-Glutamine + 15mM HEPES | Gibco | 31330-038 | |
Penicillin Streptomycin | Gibco by Life Technologies | 15070-063 | |
Special process fetal bovine serum (Sera Plus) | Pan Biotech | P30-3702 | |
Disposable Biopsy Punch | pfm medical | 48401 | |
96 Well, Black/Clear, Tissue Culture Treated Plate, Flat Bottom with Lid, sterile | Falcon / Corning | 353219 | |
Agarose, low geling temperature | Sigma | A9414-100G |