Hier presenteren we een protocol voor de bereiding van menselijke precisie-cut-Long agarose gevulde segmenten van patiënten weefsel gereseceerd die geschikt zijn voor het genereren van 3D Long weefselcultures naar model menselijke longziekten in de biologische en biomedische studies.
Vertaling van de nieuwe ontdekkingen aan ziekten bij de mens wordt beperkt door de beschikbaarheid van menselijke weefsels-gebaseerde modellen van ziekte. Precisie-cut Long segmenten (Thuiskopieerheffingen) gebruikt als 3D Long weefselcultures (3D-LTCs) een elegante vormen en biologisch zeer relevant 3D cel cultuur model, die sterk lijken op in situ weefsel vanwege hun complexiteit, biomechanica en moleculaire samenstelling. Snijden van weefsel is op grote schaal toegepast in verschillende diermodellen. 3D-LTCs afgeleid van menselijke Thuiskopieerheffingen kunnen worden gebruikt voor het analyseren van de reacties op nieuwe medicijnen, die verder helpen misschien om de mechanismen en functionele gevolgen van drugs in menselijk weefsel beter te begrijpen. De voorbereiding van Thuiskopieerheffingen van chirurgisch gereseceerd Long weefselmonsters van patiënten, die Long Lobectomie ervaren, verhoogt de bereikbaarheid van zieke en peritumoral weefsel. Hier beschrijven we een gedetailleerd protocol voor het genereren van menselijke Thuiskopieerheffingen van chirurgisch gereseceerd soft-elastisch patiënt longweefsel. Agarose werd geïntroduceerd in de ruimte van de bronchoalveolar van de resectates, dus behoud van de structuur van de longen en verhogen van de stijfheid van het weefsel, die is van cruciaal belang voor het latere snijden. 500 µm dikke sneden waren bereid uit het weefsel blok met een vibratome. Stoten van de biopsie genomen van Thuiskopieerheffingen zorgen voor vergelijkbare weefsel steekproefgrootten en verdere verhoging van het bedrag van weefselmonsters. De gegenereerde Long weefsel culturen kan worden toegepast in een aantal studies in de menselijke longen biologie, met inbegrip van de pathofysiologie en de mechanismen van de verschillende ziekten, zoals fibrotische processen op het beste bij (sub-) cellulair niveau. Het hoogste voordeel van het 3D-LTC ex vivo model is haar nauwe vertegenwoordiging van de in situ menselijke longen ten aanzien van 3D weefsel architectuur, cel type diversiteit en longkanker anatomie evenals het potentieel voor beoordeling van weefsel van individuele patiënten, die is relevant voor de verdere ontwikkeling van nieuwe strategieën voor precisie geneeskunde.
Chronische en acute longziekten zijn een belangrijke oorzaak van morbiditeit en mortaliteit wereldwijd1. Voor patiënten met chronische longziekten zoals obstructief longlijden (COPD)2, ernstige astma3, long kanker4 en diffuse parenchymal Long ziekten5zijn genezende therapieën momenteel niet beschikbaar. Hoewel studies in diermodellen voor longziekten hebben verdiept het inzicht in de ziekte pathomechanisms6 en hebben geleid tot de identificatie van potentiële nieuwe therapeutische doelen7,8,9, Deze modellen vertonen relevante biologische en fysiologische verschillen in vergelijking met mensen10. Om te overwinnen van deze verschillen tussen lymfkliertest en menselijke biologie, evenals Anatomie, menselijke ex vivo 3D Long weefselkweek worden (3D-LTC) systemen gebruikt in verschillende gebieden van het biomedisch onderzoek. Deze 3D-LTC cultuur systemen zijn gebaseerd op precisie-cut Long segmenten (Thuiskopieerheffingen). De generatie van Thuiskopieerheffingen ex vivo kunt analyse van een derde ruimtelijke dimensionaliteit, die het mogelijk voor het onderzoek van de ruimtelijke en functionele relaties tussen de cellen in de hele longblaasjes en airways11, evenals het interstitium, therapieën maakt en mesothelium. Met name zijn Thuiskopieerheffingen ex vivo modellen meercellig, wat betekent dat ze de meest functionele cellen van in situ longen bevatten, dus nauw het vertegenwoordigen van biologische oorsprong van de cellen en dus overwinnen van de beperkte cel-cel en cel-matrix interactie in meeste 2D de benaderingen van de cultuur van de cel. Tot nu toe ex vivo lymfkliertest Thuiskopieerheffingen werden gebruikt om het model van longziekten, zoals COPD12, lung fibrosis13, long kanker14, virale infectie15,16, broncho dysplasie17, en astma18. Echter een aanzienlijk deel van de roman drug therapieën in menselijke longziekten die werden onderzocht in klinische proeven niet vertalen naar de kliniek als gevolg van hun gebrek aan werkzaamheid of veiligheid, assumingly moet nog aanzienlijke verschillen tussen mens en lymfkliertest biologie en ziekte19,20,21.
Gedurende een aantal jaren hebben menselijke Thuiskopieerheffingen grotendeels zijn gebruikt ter beoordeling van de Long giftigheid van chemische stoffen en drugs. Pas onlangs, menselijke longweefsel is gebruikt van patiënten met COPD22,23, astma24en lung fibrosis25, voort te zetten van de pathofysiologische en farmacologische studies. Door met behulp van gereseceerd patiënt orgaanweefsel en het genereren van Thuiskopieerheffingen daarvan, een grote ziekte kenmerken in een complexe 3D weefsel milieu22 vertegenwoordigen en het onderhoud van de meeste van de inheemse cellulaire diversiteit van het orgel kunt herhalen. Bovendien bleek de zieke weefsel toegepast in een verscheidenheid van experimentele opstellingen om na te bootsen ziekte-achtige wijzigingen in lever-, darm- en nier26,27,28,29.
Verwerking van longweefsel blijft echter uitdagend om verschillende redenen. In tegenstelling tot stevige weefsel, native Long parenchym neiging om samenvouwen zonder ventilatie en lagere weefsel stijfheid vertoont. Deze eigenschappen belemmeren het snijden van het weefsel. Zo vullen van airways en de alveolaire ruimte met lage-melting point agarose de native Long structuur behoudt en biedt de stijfheid die nodig zijn voor precisie-cut snijden van lymfkliertest en menselijke longen30. Menselijke longen resectates gedoneerd voor onderzoeksdoeleinden zijn door hun aard anatomisch, genetisch en fysiologisch zeer divers, dus een hoge variabiliteit van Inter patiënten vaak presenteren bij het uitvoeren van experimenten25. In tegenstelling tot de hele lobe of hele Long explantaten, Long monsters gereseceerd door middel van cardio-pulmonale chirurgie niet noodzakelijkerwijs volg de anatomische segmenten en, daarom vereisen speciale voorbereiding. In dit artikel geven wij een gedetailleerde en geoptimaliseerd protocol voor het genereren van menselijke Thuiskopieerheffingen van gereseceerd longweefsel en hun latere teelt en experimenteel gebruik tot model longaandoeningen.
Het protocol beschreven in dit manuscript heeft betrekking op de generatie van Thuiskopieerheffingen van menselijke Long weefsel resectates door het te vullen met vloeibare agarose en latere vibratome snijden. Generatie van weefsel segmenten werd aangetoond voor voor een paar organen, zoals lever en hersenen, overwegende dat de inherente stijfheid van deze organen toegestaan direct snijden zonder enige wijziging van het weefsel. Van de nota is de eerste goede voorbereiding van het longweefsel de meest cruciale stap bij het genereren van Thuiskopieerheffingen. Agarose vullen van de longen is de methode van keuze te stabiliseren van het zachte en elastische karakter, en om een homogene en reproduceerbare Thuiskopieerheffingen generatie. Grote luchtwegen van de gereseceerd longweefsel zijn gecanuleerd om toegang tot de kleine luchtwegen, alsmede tot de parenchym intact longkanker. Het ontbreken van een intact borstvlies, waardoor agarose vullen bijna onmogelijk is, is een belangrijke reden waarom longweefsel meestal niet bruikbaar voor het snijden van de longen is. Prospectief, kon een synthetische borstvlies oorspronkelijk ontworpen voor het uitvoeren van functionele experimenten op decellularized steigers potentieel worden toegepast om succesvol agarose vullen van explantaten dat het gebrek aan een intact borstvlies31. Resections wat resulteert in een stuk weefsel menselijke longen met intact borstvlies zijn essentieel voor het genereren van weefsel blokken voor het snijden. Gereseceerd weefsel is meer beschikbaar is vanwege een tumor-vrije weefsel van kanker resections dan volledig intact lobben of geheel-lung explantaten van patiënten die longtransplantatie onderging.
Algemeen, twee systemen worden gebruikt voor de productie van Thuiskopieerheffingen: de Krumdieck weefsel slicer15 en vibrerende microtomes (vibratomes). Plakjes weefsel slicers genereren door een blok van weefsel door een metalen schip, dat de Thuiskopieerheffingen op 90° aan het einde van dit schip snijdt. Vibratomes genereren Thuiskopieerheffingen door het bewegen van een trillende mes horizontaal over een verankerde blok van weefsel dat is ondergedompeld in een gekoelde middellange bad, die ten opzichte van de Krumdieck-slicer oefent minder schuintrekken kracht op het weefsel. Dit resulteert in minder harde behandeling van het weefsel voor teelt. Aan de andere kant, is de vibratome snijden meer tijd en werk consumeren. In onze handen stoten vibratome de productie van een maximum van 100 Thuiskopieerheffingen of 500 Thuiskopieerheffingen ingeschakelde snijden in één dag, voldoende voor meest experimentele studies. Thuiskopieerheffingen kunnen worden gekweekt op verschillende manieren: (a) verbonden aan Trans-putjes, dus het genereren van een vloeibare air-interface (ALI) systeem, (b) als dynamische orgel cultuur (DOC), of (c) ondergedompeld in een cel kweekvloeistof bij standaard cel cultuuromstandigheden. De in-detail teelt van Thuiskopieerheffingen was eerder beschreven22,23,25; een gemeenschappelijke norm voor teelt voorwaarden tussen hun gebruik in verschillende laboratoria over de hele wereld ontbreekt echter nog. In het bijzonder de cultuur tijd misschien wel kritisch: zoals in lymfkliertest Thuiskopieerheffingen, een verlies van SFTPC positieve alveolaire type 2 cellen wordt waargenomen na 144 uur, doch uiterlijk tot 120 h22. Bovendien lijkt de metabole activiteit te blijven stabiel in lymfkliertest22 en menselijke Thuiskopieerheffingen25 voor 120 h.
Er zijn een paar technische beperkingen voor de generatie van Thuiskopieerheffingen: het aantal en de grootte van de resectates schommelt na verloop van tijd; de efficiëntie van het agarose vullen, die afhangt van de aanwezigheid van intact borstvlies binnen het verkregen weefsel, bepaalt het uiteindelijke succes van de generatie van Thuiskopieerheffingen; en weefselvernietiging veroorzaakt door pathologische veranderingen binnen de (zieke) verkregen longweefsel kan interfereren met de voorbereiding van Thuiskopieerheffingen. Airway obstakels en fibrotische weefsel ontbreekt intact alveolaire ruimte met agarose vullen en belemmeren waardoor het snijden van het fibrotische weefsel een veeleisende taak. Emphysematous weefsels als gevonden in ziekten, zoals COPD of alpha-1-anti-trypsine deficiëntie kan niet weerstaan de druk van agarose vullen, en in breuk van de longblaasjes en architecturale artefacten resulteren zal. In deze gevallen het gebruik van lage agarose concentratie, bijvoorbeeld, 1% (m/v), kan het zinvol om te verminderen van de druk en snelheid tijdens het agarose vullen. Over het geheel genomen kunt de toestand van de ziekte van het weefsel drastisch beperken het gebruik van het weefsel voor Thuiskopieerheffingen generatie. Al deze parameters bepalen de hoeveelheid Thuiskopieerheffingen die kan worden gegenereerd vanuit longweefsel, en ook de hoeveelheid tijd die het duurt om te produceren de Thuiskopieerheffingen. Verdere zijn beperkingen van Thuiskopieerheffingen tegenstrijdigheden tussen verschillende Long segmenten met betrekking tot grootte of weefsel inhoud, waarvoor verdere normalisatie stappen voor experimenten. Om dit te verhelpen, kunnen biopsie stoten van vergelijkbare regio’s in hetzelfde segment worden gegenereerd. Deze procedure is geschikt om de variabiliteit van het weefsel en, als een bijkomend voordeel, verhoging van het aantal Thuiskopieerheffingen monsters die kunnen worden gebruikt voor experimenten.
Kortom, menselijke 3D Long weefselcultures van agarose gevuld Thuiskopieerheffingen bieden een complexe menselijke model voor het bestuderen van de Fysiologie van de longen en ziekten. Het protocol bevat een gedetailleerde beschrijving van de voorbereiding van Thuiskopieerheffingen uit gereseceerd longweefsel en hun teelt, en bovendien adressen uitdagingen in agarose vullen van menselijke Long resections en hoe om ze te overwinnen.
The authors have nothing to disclose.
De auteurs zijn Marisa Neumann dankbaar voor deskundige technische bijstand. Alle weefsels van de longen werden vriendelijk geleverd door het CPC-M Bio-archief. Dit werk werd ondersteund door het Duitse centrum van longkanker onderzoek (DZL), de Helmholtz associatie- en CPC-Onderzoekschool subsidies.
Vibratome Hyrax V50 | Zeiss | – | |
Hyrax CU 65 | Zeiss | – | |
Vasofix Braunüle 18G | B. Braun Melsungen AG | 4268130B | |
30mL NORM-INJECT | Henke Sass Wolf | 4830001000 | |
Guarded disposable scalpels, sterile | Swann-Morton | ||
Loctite 406 | Henkel | LOCTITE 406 | |
Synthetic Single Crystal Sapphire | Delaware Diamond Knives | – | |
Dulbecco's Modified Eagle Medium F-12 Nutreient Mixture (Ham) + L-Glutamine + 15mM HEPES | Gibco | 31330-038 | |
Penicillin Streptomycin | Gibco by Life Technologies | 15070-063 | |
Special process fetal bovine serum (Sera Plus) | Pan Biotech | P30-3702 | |
Disposable Biopsy Punch | pfm medical | 48401 | |
96 Well, Black/Clear, Tissue Culture Treated Plate, Flat Bottom with Lid, sterile | Falcon / Corning | 353219 | |
Agarose, low geling temperature | Sigma | A9414-100G |