Adipojenik farklılaşma değerlendirirken geleneksel yöntemleri ucuz ve kullanımı kolay, ama gen ekspresyonu değişiklikler için belirli değildir. Mezenkimal hücre farklılaşması içine olgun adiposit bir soy belirli işaretçisi kullanarak ölçmek için bir tahlil geliştirdik. Bu tahlil temel araştırma ve klinik tıp arasında çeşitli uygulamalar vardır.
Çeşitli boyalari şu anda Mezenkimal hücreler farklılaşma adiposit içine algılama içinde kullanılabilir. Ucuz, kolay ve yaygın olarak kullanılan boya, yağ kırmızı O gibi Mezenkimal hücreler Adipojenik potansiyelini analiz Laboratuvarları tarafından. Ancak, onlar özel değişiklikleri gen transkripsiyonu için değildir. Mezenkimal bir hücre bir Adipojenik soy gelenlerin kaderi değiştirdi çözümlemek için gene özgü farklılaşma tahlil geliştirdik. IMMUNO-etiketi karşı yağ asidi bağlayıcı protein-4 (FABP4), bir soy özgü marker Adipojenik farklılaşma, görselleştirme ve miktar farklılaşmış hücre etkin. Adipojenik farklılaşma potansiyeli 96 iyi Mikroplaka kartvizitlere Mezenkimal hücrelerin ölçmek yeteneği uygulamaları bir dizi için umut verici sonuçları vardır. Klinik çalışmalar yüzlerce yetişkin Mezenkimal stromal hücre kullanımı dahil ve şu anda içinde ve özellikle arasında böyle klinik tedavi sonuçları ilişkilendirmek zordur. Bu basit yüksek üretilen iş FABP4 tahlil hasta elde edilen hücre farklılaşma potansiyeli değerlendirmek için bir nicel tahlil sağlar ve farklı yalıtım ve genişletme yöntemleri karşılaştırmak için güçlü bir araçtır. Bu hastalara Mezenkimal hücre ürünlerinde yönetilen hücreleri heterojen artan tanınması verilen özellikle önemlidir. Tahlil de yüksek işlem hacmi uyuşturucu tarama, özellikle ön şeker hastalığı ve obezite araştırma potansiyel yarar vardır.
Uluslararası toplum için hücresel tedavi (multipotent Mezenkimal stromal hücre tanımlamak için ISCT) tarafından kurulan anahtar gereksinimleri hücreleri Adipojenik ve Osteojenik chondrogenic soy ayırmak için yetenek olmalıdır biridir 1. farklılaşma üç bu soy içine ölçme geleneksel yöntemlerle makromoleküllerin ürünleri kimyasal boyalar1kullanarak algılamayı güveniyor. Boya yağ kırmızı O, (Bu adipogenesis uğramıştır hücrelerdeki yağ damlacıkları lekeleri) gibi ucuz ve kullanımı kolay; Ancak onlar Mezenkimal hücrelerin her ilgili lineage2ayırt adlandırırken gen ifadesinde belirli değişiklikleri algılamak başarısız. Burada, bir Adipojenik lineage özgü marker, yağ asidi bağlayıcı protein-4 (FABP4)3,4,5için protein ifade quantifies bir farklılaşma tahlil geliştirdik. FABP4 başlangıçta fare 3T3-L1 adiposit3 ‘ te bulundu ve daha sonra insan deri altı yağ dokusu6‘ ifade edilecek keşfedilmiştir. Bu yağ asidi alımını hücreleri tarafından rehberlik için bir refakatçi olarak geçecek olan ve, lipoliz4sürecinde ilgilenmektedir sitozolik bir proteindir.
Farklılaşma deneyleri için kullanılan habercisi hücre adipose türetilmiş Mezenkimal stromal hücreler (ASCs)7,8vardı. ASCs kemik iliği elde edilen Mezenkimal Kök hücre (BM-MSCs), bir büyük Mezenkimal Kök hücre nüfus yetişkin8,9ile birçok özellikleri paylaşır. Derecede hücrelerinin daha fazla verim-ebilmek var olmak daha kolay erişilebilir hale doku kaynakları8,9izole ASCs bir klinik uygulamada, BM-MSCs üzerinde birkaç avantaj sunar. Bir izole hücre nüfus ASCs tanımlanacak bazı ölçütlere uyması gerekir. İlk olarak, standart kültür koşulları1‘ plastik doku kültürü damarları bağlılığı göstermek gerekir. Onlar da belirli yüzey antijeni ifade1göstermek gerekir. Kültürsüz ASCs, CD34, CD73, CD90, düşük CD105 ifadesidir ve CD45 ve HLA-DR10negatif ifade pozitif yüzey antijeni ifade tarafından karakterize edilmektedir. Plastiğin üzerinde 28 (yapışık ASCs saf) gün boyunca kültür tarafından saf ASCs CD73, CD90 ve CD105 olumlu ifade ve CD34, CD45 ve HLA-DR10negatif ifade gösterir. Son olarak, hücrelerin çeşitli soy1,7,8içine ayırt etmek için yetenek korumanız gerekir.
Biz İmmünokimya FABP4 protein hücreleri içinde görselleştirmek için kullanılan ve tek hücre düzeyinde FABP4 ifade sayısal Adipojenik farklılaşma protokolleri FABP4 ifade diğer adipocyte lineage genler arasında çarpıcı upregulation ikna etmek bir otomatik floresan yüksek içerik tarama mikroskop kullanarak. Adipocyte-lineage farklılaşma çok özel onay sağlar gibi bu yöntem geleneksel boyalar üzerinde avantajlıdır. Ayrıca yöntemleri tarama yüksek içerik ile kombine böyle gen belirli lineage deneyleri miktar orantılı bir türdeş olmayan hücre hazırlık içindeki belirli bir soy aşağı farklılaşma yeteneğine hücreleri etkinleştirin. Bizim çalışmalarda Adipojenik farklılaşma potansiyeli taze izole ASCs kaybı hücre kültürü sonra onaylamak için FABP4 tahlil kullanılır.
Bu kağıt yardımcı programı ve doğru algılamak ve olgun adiposit Mezenkimal stromal hücrelerden türetilmiş ölçmek FABP4 immunolabelling avantajlarını gösteriyor. FABP4 hangi etiket makromoleküllerin13,14 olur boyalar değişiklikleri bir soy belirli protein3,4,5 diğer yaygın aksine olgun adiposit’ifadesinde kullanılan tespit edebilmektedir petrol kırmızı O15, Nil kırmızı16 ve Sudan siyah17gibi. Görselleştirme ve değişiklikleri hücresel Morfoloji analizi için FABP4 immunolabelling sağlar. Önceden açıklanan yöntemleri kullanarak nicel ters transkripsiyon değişiklikler olmadan herhangi bir görüntüleme5,18,19 transkript düzeyde analiz eden PCR (RT-qPCR) üzerinde belirgin bir avantaj bu ,20veya süspansiyon20veya Western Blot bu olması için hücrelerin gerekli Akış Sitometresi hücrelerin protein19,20yalıtmak için lysed gerekir. FABP4 immunolabelling sabit hücrelerde stabil, çözümde kaçak değil ve ne zaman içinde hücre, yapisan bir monolayer etiketli sitozolik protein olmak kolay görüntüleme için izin ve doğruluk otomatik analizde ekledi çekirdek ile çakışır.
Çünkü hızlıdır, doğrudur, tekrarlanabilir ve objektif yüksek içerik tarama avantajlıdır. Resim alma ve analiz en az el ile manipülasyonu gerektirir ve araç otomatik işlenmesini itimat reaktifler ve araştırmacı zaman, maliyet etkin kullanımı için bir platform sağlar. Çeşitli faktörler doğruluğu için kritik olarak tespit edilmiştir ve tekrarlanabilirlik yüksek içerik tarama31deneyleri. Antijen ifade miktar görüntü kalitesi üzerinde dayanır. Başarılı görüntü analizi için her kanal başına iyi görüntülerden odakta olmalı ve bir en uygun dinamik gri değerler için aralıkta (ayarları otomatik maruz ideal). Dışarı-in odak veya hatalı sonuçlar doymuş görüntüleri yol açabilir.
Bu makalede açıklanan yöntemlerden potansiyel bazı sınırlamalar şunlardır. Özel görüntüleme ekipman ve analiz yazılımı gereksinimini. Bu makalenin kapsamı ise dışında alternatif açık kaynak yazılım seçenekleri (örneğin, ImageJ32,33, Fiji34, CellProfiler32,35) benzer görüntü segmentasyonu gerçekleştirmek için kullanılabilir görevleri; ancak indirmek ve online kullanılabilir makrolar terzi veya makrolar/komutları onların belirli analiz boru hatları için beceri gerektirir. Arka plan gürültü seviyesi tüm otomatik görüntü analiz boru hatları için doğasında vardır. Bu büyük ölçüde enkaz için bağlanabilir dikkatli numune hazırlama ve görüntüleme ve çözümleme platformu dikkatli kurulum ihtiyacını vurgulayan kötü görüntü kalite veya çözümleme hatası. FABP4 etiket farelerde farklılaşmamış ataları30algılamak tespit edilmiştir; (Bu farklılaşmamış hücreleri oluşur) Bu çalışmada denetimlerde belirli FABP4 boyama yoksun olsa da. FABP4 ifade iade gerekliliği ataları nerede tahlil istihdam her biyolojik bağlamda farklılaşmamış bu eksik puanları.
FABP4 etiketleme ve yağ kırmızı boyama, O biyolojik ilgili olması gereken görüntü analizi üzerinden çıkış ölçümleri arasında geçerli karşılaştırmalar çizmek için. Sonuç olarak, ölçüm, “% pozitif hücreler” FABP4 için kullanılan ve “Hücre başına boyama alanı” petrol kırmızı O. için kullanıldı Bu ölçü birimi ‘% pozitif hücreler’ petrol kırmızı etiketli yağ damlacıkları doğru belirli bir çekirdek için öznitelik mümkün değildi çünkü hücreleri çalışma etiketli O için kullanılmadı dikkat çekicidir; yağ damlacıkları önemli ölçüde çeşitli boyut, sayı ve dağıtım hücre vücut ve nadiren çekirdekle üst üste. Farklı doku kaynaklardan elde hücreleri arasında yağ kırmızı değişkenlik boyama O var; % pozitif hücreler ölçü geçerli çalışma için uygun değildi, başka bir grup başarıyla insan bezi kök hücre22 türetilmiş adiposit ölçmek için nerede petrol kırmızı O boyama yayılmış bir büyük şişman damlacık çıktı kullanılmış sitoplazma ve çekirdekleri ve % pozitif hücreler olarak sunulmak üzere etkinleştirme verileri ile örtüşen.
Buna ek olarak, FABP4 immunolabelling Morfoloji farklı doku kaynakları23,24,25aralığından elde edilen adiposit içinde tutarlıdır. Hücre farklılaşma yeteneğine sahip bir kültür içinde oranı ölçmek için bir sayı-in kullanma yeteneği. Yetişkin Mezenkimal stromal hücreler çok çeşitli tedavi kullanımlar için önemli sözü tutun. Bu hücreler hastalar26arasında yalıtım27,28siteler arasında ve yalıtım12 için yöntemler arasında kapasitesini doğal değişkenlik klinik çeviri ile ortaya çıkmıştır önemli bir sorun olduğunu ve terapötik kullanım için hücre sayıları12 genişlemesi. Bu daha önce gösterilmiştir yapisan stromal hücre kültürleri sık türdeş olmayan, bazı hücrelerin farklılaşma ve bazı değil 12,17 olarak bizim FABP4 ile tahlil ASC kültürler için gösterir. Bu şekilde deneyleri, zenginleştirme teknikleri ile kombine, heterojen kültürlerin lineage özgü farklılaşma yetenekli içinde alt nüfus tanımlanmasına yardımcı olacak. Bu FABP4 tahlil gibi standart, ölçülebilir tahlil sahip tüm bu değişkenler ve tedavi sonuçları içinde ve klinik çalışmalar arasında değerlendirmek için potansiyel arasında karşılaştırma için basit bir yöntem sağlar.
FABP4 miktar yarı otomatik bir biçimde objektiflik ve tekrarlanabilirlik analizde birçok donör servis taleplerini ve örnekler sağlar. Ayrıca etiketin sitoplazmik olduğu gibi bu sorunlara neden olabilir hipertrofisi (adipocyte boyutu büyütme) Hiperplazi (adipocyte numarası artış), ek olarak obezite araştırma, oldukça önem taşıyor bir ayrım olarak çözümlemeye nerede hipertrofisi şiddetle obez bireyler21adipose disfonksiyonu ile ilişkilidir. Obezite salgın önemli miktarda uyuşturucu lipid depolama kontrol yetenekli belirlenmesinde ilgi mahmuzlu vardır. Bu FABP4 tahlil de bileşikleri lipid birikimi etkisizleştirmek yeteneklerini için binlerce eleme için basit bir okuma sağlar.
The authors have nothing to disclose.
Yağ doku ve toplamak ve bu kaynak araştırma kullanım için bize sağlar araştırma uzmanları bağış için minnettarız. Destek Allergan tarafından fon kabul etmek istiyoruz. Ayrıca videoyu ve düzenleme için bu makalenin gönderme maliyeti finansmanı için Auckland Üniversitesi, Tıp Fakültesi ve Sağlık Bilimleri performans dayalı Araştırma Fonu için minnettarız.
Tris Base | Invitrogen | 15504-020 | Tris buffered saline |
Sodium Chloride | Merck | 1064041000 | Tris buffered saline |
Potassium Chloride | Merck | 1049360500 | Tris buffered saline |
Sodium Azide | Scharlau | SO0091 | Casein blocker solution |
Casein | Sigma | C7078-500G | Casein blocker solution |
PBS tablet | Sigma | P4417-100TAB | Phosphate buffered saline |
DMEM/F12 | Gibco | 11330-032 | Cell culture |
Penicillin/streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | Cell culture |
Glutamax | Gibco | 35050-061 | Cell culture |
Fetal bovine serum | Gibco | 10091-148 | Cell culture |
TrypLE Select Enzyme (1X), no phenol red | Gibco | 12563-029 | Cell dissociation enzyme |
96 well plate (flat bottom) | Falcon | FAL353072 | Cell culture equipment |
T75 culture flask, with filter cap | Greiner | 658175 | Cell culture equipment |
Insulin | Sigma | 19278-5ML | Adipogenic differentiation media |
dexamethasone | Sigma | D2915-100MG | Adipogenic differentiation media |
indomethacin | sigma | I7378-5G | Adipogenic differentiation media |
Oil-Red O | Sigma | O-0625 | Classic stain for adipogenesis |
Isopropanol | Merck | 1.09634 | Classic stain for adipogenesis |
16% formaldehyde | Pierce | 28908 | Cell fixation |
Acetone | Merck | 100983 | Cell fixation |
DAPI | Sigma | D9542 | Immunocytochemistry |
Anti rabbit IgG alexa 488 | Molecular Probes | A11008 | Immunocytochemistry |
Thimerosal | Sigma | T5125-10G | Immunocytochemistry |
Rabbit anti-human fatty acid binding protein 4 (FABP4) antibody | Cayman Chemicals | 10004944 | Marker of adipogenesis |
Centrifuge tubes (15mL) | Greiner | GR188271 | General |
Centrifuge tubes (50mL) | Greiner | GR227261-P | General |
ImageXpress Micro XLS | Molecular Devices | high content screening machine | |
MetaXpress | Molecular Devices | high content screening software, version 5.4.01 |