Los métodos tradicionales de evaluación de diferenciación adipogenic son baratos y fácil de usar, pero no son específicos a los cambios en la expresión génica. Hemos desarrollado un ensayo para cuantificar la diferenciación de células mesenquimales en adipocytes maduros usando un marcador específico de linaje. Este ensayo tiene diversas aplicaciones en investigación básica y la medicina clínica.
Varios colorantes están disponibles para su uso en la detección de la diferenciación de células mesenquimales en adipocitos. Tintes, tales como aceite rojo O, son baratos, fáciles de usar y ampliamente utilizada por laboratorios analizar el potencial de adipogenic de células mesenquimales. Sin embargo, no son específicos a los cambios en la transcripción del gene. Hemos desarrollado un ensayo de diferenciación gene-específico para analizar cuando una célula mesenquimal ha cambiado su destino a un linaje de adipogenic. Inmuno-etiquetado contra ácidos grasos Unión proteína-4 (FABP4), un marcador de linaje-específicas de diferenciación adipogenic, permitió la visualización y cuantificación de células diferenciadas. La capacidad de cuantificar adipogenic potencial de diferenciación de células mesenquimales en un formato de 96 microplate pozo tiene implicaciones prometedoras para un número de aplicaciones. Cientos de estudios clínicos involucran el uso de células estromales mesenquimales adultas y es actualmente difícil correlacionar los resultados terapéuticos dentro y sobre todo entre estos ensayos clínicos. Este ensayo de FABP4 simple de alto rendimiento ofrece un ensayo para evaluar el potencial de diferenciación de células derivadas del paciente y es una robusta herramienta para comparar diferentes métodos de aislamiento y expansión. Esto es particularmente importante dado el creciente reconocimiento de la heterogeneidad de las células siendo administrado a los pacientes en los productos de células mesenquimales. El análisis también tiene utilidad potencial en la detección de drogas de alto rendimiento, particularmente en la investigación de la obesidad y la diabetes.
Uno de los requisitos fundamentales establecidos por la sociedad internacional de terapia celular (ISCT) para definir una células estromales mesenquimales multipotentes es que las células tienen la capacidad de diferenciarse en la adipogenic osteogénica y condrogénica linajes 1. métodos convencionales de medición de diferenciación en estos tres linajes se basan en la detección de productos macromoleculares con tintes químicos1. Tintes como el aceite O rojo (que las manchas de gotitas de grasa en las células que han sufrido la adipogénesis), son baratos y fácil de usar; sin embargo no llegan a detectar los cambios específicos en la expresión génica que ocurren cuando las células mesenquimales se diferencian en cada respectivo linaje2. Aquí, hemos desarrollado un ensayo de diferenciación que cuantifica la expresión de la proteína para un marcador de linaje específico adipogenic, ácidos grasos Unión proteína-4 (FABP4)3,4,5. FABP4 fue encontrado inicialmente en adipocitos de ratón 3T3-L13 y fue descubierto más adelante para ser expresado en el tejido adiposo subcutáneo humano6. Es una proteína citosólica, que actúa como un acompañante para guiar la absorción de ácidos grasos por las células y participa en el proceso de lipólisis4.
Las células del precursor utilizadas para los ensayos de diferenciación eran células estromales mesenquimales derivadas adiposas (ASCs)7,8. ASCs comparten muchas propiedades con médula ósea células madre mesenquimales (MSCs-BM), una población de células mesenquimales principales en adultos8,9. ASCs ofrecen varias ventajas sobre los BM-MSCs en una aplicación clínica, como mayor rendimiento de las células puede ser aislado del tejido más accesibles fuentes8,9. Una población aislada de la célula debe cumplir ciertos criterios para definir como ASC. En primer lugar, deben demostrar cumplimiento de recipientes de cultivo de tejido plástico en condiciones de cultivo estándar1. También deben demostrar expresión de antígeno específico de la superficie1. ASCs incultos se caracterizan por la expresión del antígeno de superficie positivo de CD34, CD73, CD90, baja expresión de CD105 y negativa expresión de CD45 y HLA-DR10. ASCs purificadas por cultivo en plástico durante 28 días (adherente purificada ASCs) muestran expresión positiva de CD73, CD90 y CD105 y negativa expresión de CD34 y CD45, HLA-DR10. Por último, las células deben conservar la capacidad de diferenciarse en varios linajes1,7,8.
Protocolos de diferenciación de Adipogenic inducen llamativa upregulation de FABP4 expresión entre otros genes del linaje de adipocito, así que utilizado inmunoquímica para visualizar FABP4 proteína dentro de las células y luego cuantifica FABP4 expresión a nivel unicelular utilizando un microscopio de proyección de alto contenido fluorescente automatizado. Este método es ventajoso sobre tintes tradicionales ya que permite la confirmación específica de la diferenciación del adipocito-linaje. Tales ensayos de linaje específico de genética combinados con alto contenido métodos de cribado también permiten la cuantificación de la proporción de células dentro de una preparación de células heterogéneas que son capaces de diferenciación por un linaje particular. En nuestros estudios hemos utilizado el ensayo FABP4 para confirmar la pérdida del potencial de diferenciación de adipogenic de ASCs recientemente aisladas después de cultivo celular.
Este trabajo muestra la utilidad y ventajas de FABP4 immunolabelling para detectar y cuantificar adipocytes maduros derivados de células estromales mesenquimales exactamente. FABP4 es capaz de detectar cambios en la expresión de un linaje específico proteína3,4,5 en adipocytes maduros, contrario a otros comúnmente utilizan tintes que etiqueta macromolecular cambia13,14 como aceite rojo O15, Nilo rojo16 y17de Sudán negro. FABP4 immunolabelling permite la visualización y análisis de cambios en la morfología celular. Esto es una ventaja distintiva sobre métodos previamente descritos cuantitativa transcripción reversa PCR (RT-qPCR) que analiza los cambios en el nivel de transcripción sin cualquier visualización5,18,19 ,20o citometría de flujo que requiere que las células en suspensión20o Western Blot que necesita para la lisis para aislar proteínas19,20. FABP4 immunolabelling es estable en las células fijas, no se escapa hacia fuera en la solución y que es una proteína citosólica cuando etiquetados en una monocapa adherente de las células, se traslapará con el núcleo que permite fácil visualización y añade precisión en el análisis automatizado.
Proyección de alto contenido es ventajoso porque es rápido, preciso, reproducible y objetiva. Proporciona una plataforma para el uso rentable de los reactivos y el tiempo del investigador, desde análisis y adquisición de imágenes requieren mínima manipulación manual y se basan en el procesamiento automático del instrumento. Varios factores fueron identificados como críticos para la exactitud y reproducibilidad de la investigación de alto contenido ensayos31. La cuantificación de la expresión del antígeno depende de la calidad de imagen. Para el análisis acertado de la imagen, las imágenes de cada canal por bien deben en foco y caen dentro de un rango dinámico óptimo para valores de gris (configuración Auto exponer es ideales). Fuera de foco o imágenes saturadas conducen a resultados erróneos.
Algunas limitaciones potenciales de los métodos descritos en este artículo incluyen los siguientes. El requisito para especializado software equipo y análisis de imágenes. Mientras que fuera del alcance de este artículo, opciones de software de código abierto alternativa (por ejemplo, ImageJ32,33, Fiji34, CellProfiler32,35) se pueden utilizar para realizar segmentación similar tareas; sin embargo que requieren de habilidad para descargar y adaptar macros disponibles en línea o escribir macros/comandos de sus tuberías de análisis específico. Inherente a las tuberías todo automatizado de análisis proyección de imagen es un nivel de ruido de fondo. Esto se puede atribuir en gran parte a la ruina, error de calidad o análisis de mala imagen, haciendo hincapié en la necesidad de preparación de muestras cuidadosa y cuidadosa preparación de la plataforma de proyección de imagen y análisis. Se ha encontrado la etiqueta de FABP4 en ratones para detectar progenitores indiferenciados30; mientras que los controles en este estudio (que consisten de células indiferenciadas) están desprovistos de tinción específica de FABP4. Esta partituras bajo la necesidad de comprobar la expresión FABP4 en undifferentiated progenitores en cada contexto biológico donde se emplea el ensayo.
Con el fin de establecer comparaciones válidas entre el etiquetado FABP4 y aceite rojo O manchas, las medidas de salida del análisis de imagen necesarios para ser biológicamente relevantes. En consecuencia, la medida, ‘% de células positivas’ fue utilizada para FABP4, y “zona de coloración por la célula” fue utilizada para aceite rojo O. Cabe destacar que la medida «% de células positivas» no fue utilizada para aceite rojo O con las células en nuestro estudio, porque no era posible atribuir las gotitas gordas etiquetadas con precisión a un núcleo determinado; las gotitas de grasa variaban considerablemente en tamaño, número y distribución en todo el cuerpo de la célula y rara vez coincidía con el núcleo. Aceite rojo O manchas variabilidad existe entre las células derivadas de tejido diferentes fuentes; mientras que el % positivo células medida no era apropiado para el estudio actual, otro grupo lo ha utilizado con éxito para cuantificar adipocitos derivados de glándula humano células de vástago22 donde el aceite rojo O coloración apareció como una gotita de grasa grande que abarcó el citoplasma y comprometidos con los núcleos y datos que permite presentarse como % de células positivas.
En cambio, la morfología de FABP4 immunolabelling es consistente en los adipocitos derivadas de una variedad de tejido diferentes fuentes23,24,25. La capacidad de cuantificar la proporción de células dentro de una cultura capaz de diferenciación tiene un número de aplicaciones. Las células estromales mesenquimales adultas mantenga una promesa significativa para una amplia gama de aplicaciones terapéuticas. Una cuestión importante que ha surgido con la traducción clínica es la variabilidad inherente en la capacidad de estas células entre pacientes26, entre sitios de aislamiento27,28y entre los métodos para el aislamiento de12 y ampliación de la celda número12 para uso terapéutico. Se ha demostrado previamente que las culturas de las células estromales adherentes son con frecuencia heterogéneas, con algunas células capaces de diferenciación y algunos no 12,17 como nuestro FABP4 ensayo muestra las culturas de la ASC. Estudios como este, combinado con técnicas de enriquecimiento, ayudará a identificar las subpoblaciones dentro de las culturas heterogéneas capaces de diferenciación linaje-específicas. Tener un análisis estandarizado y cuantificable como este ensayo FABP4 proporciona un método simple para la comparación entre todas estas variables y el potencial para evaluar los resultados terapéuticos dentro de y entre los ensayos clínicos.
La cuantificación de FABP4 de manera semiautomática permite objetividad y reproducibilidad en el análisis a través de muchos casos de donantes y muestras. Además la etiqueta es citoplasmática, puede potencialmente ser utilizado para analizar la hipertrofia (agrandamiento del tamaño del adipocito) además de hiperplasia (aumento en el número de adipocitos), una distinción que es de considerable importancia en la investigación de la obesidad, donde la hipertrofia es fuertemente asociada con la disfunción adiposa en personas obesas21. La epidemia de obesidad ha impulsado una gran cantidad de interés en la identificación de fármacos capaces de controlar el almacenamiento de lípidos. Este ensayo de FABP4 también proporciona una lectura sencilla para la detección de miles de compuestos por su capacidad inhibir la acumulación de lípidos.
The authors have nothing to disclose.
Agradecemos a los donantes de los tejidos adiposo y los profesionales de la investigación que recogen y nos proporcionan este recurso para uso en investigación. Nos gustaría reconocer fondos por Allergan. También agradecemos a la Universidad de Auckland, Facultad de medicina y salud Ciencias Performance basado en investigación del fondo para la financiación de los gastos de videoing y edición para la presentación de este artículo.
Tris Base | Invitrogen | 15504-020 | Tris buffered saline |
Sodium Chloride | Merck | 1064041000 | Tris buffered saline |
Potassium Chloride | Merck | 1049360500 | Tris buffered saline |
Sodium Azide | Scharlau | SO0091 | Casein blocker solution |
Casein | Sigma | C7078-500G | Casein blocker solution |
PBS tablet | Sigma | P4417-100TAB | Phosphate buffered saline |
DMEM/F12 | Gibco | 11330-032 | Cell culture |
Penicillin/streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | Cell culture |
Glutamax | Gibco | 35050-061 | Cell culture |
Fetal bovine serum | Gibco | 10091-148 | Cell culture |
TrypLE Select Enzyme (1X), no phenol red | Gibco | 12563-029 | Cell dissociation enzyme |
96 well plate (flat bottom) | Falcon | FAL353072 | Cell culture equipment |
T75 culture flask, with filter cap | Greiner | 658175 | Cell culture equipment |
Insulin | Sigma | 19278-5ML | Adipogenic differentiation media |
dexamethasone | Sigma | D2915-100MG | Adipogenic differentiation media |
indomethacin | sigma | I7378-5G | Adipogenic differentiation media |
Oil-Red O | Sigma | O-0625 | Classic stain for adipogenesis |
Isopropanol | Merck | 1.09634 | Classic stain for adipogenesis |
16% formaldehyde | Pierce | 28908 | Cell fixation |
Acetone | Merck | 100983 | Cell fixation |
DAPI | Sigma | D9542 | Immunocytochemistry |
Anti rabbit IgG alexa 488 | Molecular Probes | A11008 | Immunocytochemistry |
Thimerosal | Sigma | T5125-10G | Immunocytochemistry |
Rabbit anti-human fatty acid binding protein 4 (FABP4) antibody | Cayman Chemicals | 10004944 | Marker of adipogenesis |
Centrifuge tubes (15mL) | Greiner | GR188271 | General |
Centrifuge tubes (50mL) | Greiner | GR227261-P | General |
ImageXpress Micro XLS | Molecular Devices | high content screening machine | |
MetaXpress | Molecular Devices | high content screening software, version 5.4.01 |