Metodi tradizionali di valutazione adipogenico differenziazione sono economici e facili da usare, ma non sono specifici di cambiamenti nell’espressione genica. Abbiamo sviluppato un test per quantificare la differenziazione delle cellule mesenchimali in adipociti maturi con un pennarello specifico lignaggio. Questo test ha diverse applicazioni attraverso la ricerca di base e della medicina clinica.
Diversi coloranti sono attualmente disponibili per uso nella rilevazione della differenziazione delle cellule mesenchimali in adipociti. Coloranti, come Oil Red O, sono a buon mercato, facile da usare e ampiamente utilizzato dai laboratori analizzando il potenziale adipogenico delle cellule mesenchimali. Tuttavia, essi non sono specifici di modifiche nella trascrizione genica. Abbiamo sviluppato un test di differenziazione di gene-specifico per analizzare quando una cellula mesenchymal ha cambiato il suo destino a un lignaggio adipogenico. Immuno-etichettatura contro acidi grassi binding protein-4 (FABP4), un indicatore di lineage-specifici di differenziazione adipogenico, abilitata visualizzazione e quantificazione delle cellule differenziate. La capacità di quantificare adipogenico potenziale di differenziazione delle cellule mesenchimali in un formato di micropiastre ben 96 ha implicazioni promettenti per un numero di applicazioni. Centinaia di studi clinici implicano l’uso di cellule stromali mesenchimali adulte ed è attualmente difficile da correlare i risultati terapeutici all’interno e soprattutto tra tali sperimentazioni cliniche. Questo semplice test FABP4 ad alta velocità fornisce un’analisi quantitativa per la valutazione del potenziale di differenziazione delle cellule derivate dal paziente ed è un robusto strumento per confrontare diversi metodi di isolamento ed espansione. Ciò è particolarmente importante dato il crescente riconoscimento dell’eterogeneità delle cellule viene somministrato ai pazienti nei prodotti delle cellule mesenchimali. Il saggio ha anche potenziale utilità in screening di stupefacenti throughput elevato, specialmente nella ricerca di obesità e pre-diabete.
Uno dei requisiti fondamentali stabiliti dalla società internazionale per la terapia cellulare (ISCT) per definire una cella stromale mesenchimale multipotente è che le cellule devono avere la capacità di differenziarsi in adipogenico, osteogenico e lignaggi condrogenica 1. metodi di differenziazione in queste tre stirpi di misura convenzionali si basano sulla rilevazione di prodotti macromolecolari utilizzando coloranti chimici1. Coloranti ad esempio Oil Red O (che le macchie di goccioline di grasso nelle cellule che hanno subito il adipogenesis), sono a buon mercato e facile da usare; Tuttavia non riescono a rilevare i cambiamenti specifici nell’espressione genica che si verificano quando le cellule mesenchimali differenziarsi in ogni rispettivo lineage2. Qui, abbiamo sviluppato un test di differenziazione che quantifica l’espressione della proteina per un indicatore di stirpe-specific adipogenico, associazione di acido grasso protein-4 (FABP4)3,4,5. FABP4 è stato inizialmente trovato in murini 3T3-L1 adipocytes3 e più successivamente è stato scoperto per essere espresso nel tessuto adiposo sottocutaneo umano6. È una proteina citosolica, che agisce come chaperon per guidare l’assorbimento degli acidi grassi dalle cellule ed è coinvolta nel processo di lipolisi4.
Le cellule del precursore utilizzate per le analisi di differenziazione erano cellule stromali mesenchimali derivate adiposa (ASCs)7,8. ASC condividono molte proprietà con derivate da midollo osseo cellule staminali mesenchimali (BM-MSCs), una popolazione di cellule staminali mesenchimali principali in adulti8,9. ASC offrono parecchi vantaggi sopra BM-MSCs in un’applicazione clinica, come una maggiore resa delle cellule può essere isolata dal tessuto più facilmente accessibili fonti8,9. Una popolazione isolata delle cellule deve soddisfare determinati criteri per essere definito come ASC. In primo luogo, devono mostrare aderenza ai recipienti di plastica tessuto coltura in condizioni di coltura standard1. Inoltre devono mostrare l’antigene di superficie specifica espressione1. Uncultured ASCs sono caratterizzate dall’espressione dell’antigene di superficie positivo di CD34, CD73, CD90, bassa espressione di CD105 ed espressione negativa di CD45 e HLA-DR10. ASC purificato mediante coltura su plastica per 28 giorni (aderente purificato ASCs) mostrano espressione positiva di CD73, CD90 e CD105 ed espressione negativa di CD34, CD45 e HLA-DR10. Infine, le cellule devono conservare la capacità di differenziarsi in vari lignaggi1,7,8.
Protocolli di differenziazione adipogenico inducono notevole upregulation dell’espressione FABP4 tra altri geni di lignaggio del adipocyte, così abbiamo usato immunochimica per visualizzare FABP4 proteine all’interno delle cellule e poi quantificato FABP4 espressione a livello di singola cellula utilizzando un microscopio di screening ad alto contenuto fluorescente automatizzato. Questo metodo è vantaggioso sopra coloranti tradizionali, in quanto consente altamente specifica conferma di differenziazione del adipocyte-stirpe. Tali dosaggi di stirpe specifico gene combinati con alto contenuto di metodi di screening anche permettono una quantificazione della percentuale di cellule all’interno di una preparazione eterogenee delle cellule che sono in grado di differenziazione verso il basso un particolare lignaggio. Nei nostri studi abbiamo usato l’analisi FABP4 per confermare la perdita del potenziale di differenziazione adipogenico di recente isolate ASCs dopo coltura cellulare.
Questa carta dimostra l’utilità e i vantaggi di FABP4 immunolabelling accuratamente rilevare e quantificare adipocytes maturi derivato dalle cellule stromali mesenchimali. FABP4 è in grado di rilevare cambiamenti nell’espressione di un lignaggio specifica proteina3,4,5 negli adipociti maturi, al contrario di altri comunemente utilizzati coloranti quale etichetta macromolecolare cambia13,14 come Oil Red O15, Nilo rosso16 e Sudan nero17. FABP4 immunolabelling consente di visualizzazione e l’analisi dei cambiamenti nella morfologia cellulare. Questo è un vantaggio distintivo rispetto ai metodi precedentemente descritti utilizzando quantitativa trascrizione d’inversione PCR (RT-qPCR) che analizza le modifiche a livello di trascrizione senza qualsiasi visualizzazione5,18,19 ,20, o citometria a flusso che richiede le cellule in sospensione20o Western blotting che richiede le cellule per essere lisati per isolare proteine19,20. Immunolabelling FABP4 è stabile in celle fisse, non fuoriuscire in soluzione ed essendo una proteina citosolica quando etichettati in un aderente monostrato di cellule, si sovrappongono con il nucleo consentendo facile visualizzazione e aggiunto precisione nell’analisi automatizzata.
Lo screening ad alto contenuto è vantaggioso perché è veloce, preciso, riproducibile ed oggettivo. Fornisce una piattaforma per uso redditizio di reagenti e tempo ricercatore, poiché analisi e acquisizione di immagini richiedono minima manipolazione manuale e si basano sull’elaborazione automatica dello strumento. Diversi fattori sono stati identificati come critico per la precisione e la riproducibilità dello screening ad alto contenuto saggi31. La quantificazione dell’espressione dell’antigene si basa sulla qualità dell’immagine. Per l’analisi di immagine di successo, immagini da ogni canale per pozzetto devono essere a fuoco e cadere all’interno di una gamma dinamica ottimale per i valori di grigio (impostazioni Auto esporre sono ideali). Fuori della messa a fuoco o immagini sature di portare a risultati errati.
Alcune potenziali limitazioni dei metodi descritti in questo articolo sono i seguenti. Il requisito per specializzata attrezzature e analisi software di imaging. Mentre all’esterno dell’ambito di questo articolo, le opzioni di software open source alternativi (ad esempio, ImageJ32,33, Fiji34, CellProfiler32,35) possono essere utilizzate per eseguire la segmentazione di immagini simili attività; Tuttavia essi richiedono la capacità di scaricare e personalizzare le macro disponibili online oppure scrivere macro/comandi per loro condotte analisi specifica. Inerente a tutto automatizzato imaging analisi condotte è un livello di rumore di fondo. Questo può essere attribuito in gran parte ai detriti, immagine scarsa qualità o analisi errore, sottolineando la necessità di preparazione del campione attento e accurato set-up della piattaforma di imaging e l’analisi. L’etichetta di FABP4 nei topi è stato trovato per rilevare progenitori indifferenziati30; mentre i controlli in questo studio (che consistono di cellule indifferenziate) sono privi di colorazione specifica FABP4. Questo sotto-punteggi la necessità di controllare FABP4 espressione indifferenziato dei progenitori in ogni contesto biologico dove è impiegato il dosaggio.
Al fine di fare un confronto valido tra l’etichettatura FABP4 e Oil Red O colorazione, le misurazioni di uscita dalle analisi di immagine dovuto essere biologicamente rilevanti. Di conseguenza, la misurazione, ‘% cellule positive’ è stata usata per FABP4 e ‘zona di macchiatura per cella’ è stata usata per olio rosso O. È interessante nota che la misura ‘% cellule positive’ non è stata utilizzata per Oil Red O etichettati cellule nel nostro studio perché non era possibile attribuire le goccioline grasse etichettate con precisione ad un determinato nucleo; le goccioline grasse ha variato considerevolmente in dimensioni, numero e distribuzione in tutto il corpo cellulare e raramente coincidevano con il nucleo. Oil Red O macchiatura variabilità esistente tra cellule derivate da fonti differenti del tessuto; mentre il % positivo cellule misura non era appropriato per lo studio corrente, un altro gruppo ha utilizzato con successo per quantificare adipociti derivate da cellule staminali di ghiandola umana22 dove la macchiatura Oil Red O appariva come una grande goccia di grasso che ha misurato la citoplasma e sovrapposte con nuclei e abilitanti i dati verranno presentati come % di cellule positive.
Al contrario, la morfologia del immunolabelling FABP4 è coerenza nei adipocytes derivato da una fascia di tessuto differenti fonti23,24,25. La capacità di quantificare la proporzione di cellule all’interno di una cultura capace di differenziazione ha un numero di applicazioni. Cellule stromali mesenchimali adulte tengono la promessa significativa per una vasta gamma di usi terapeutici. Un problema significativo che è sorto con traduzione clinica è la variabilità inerente nella capacità di queste cellule tra pazienti26, tra siti di isolamento27,28e tra i metodi per l’isolamento12 e l’espansione della cella numero12 per uso terapeutico. Ha dimostrato in precedenza che culture di cellule stromale aderenti sono spesso eterogenee, con alcune cellule capaci di differenziazione e alcuni non 12,17 come nostro FABP4 saggio dimostra per le culture ASC. Saggi come questo, combinato con tecniche di arricchimento, consentirà di identificare sub-popolazioni all’interno di culture eterogenee in grado di differenziazione di lineage-specifici. Avendo un test standardizzato, quantificabile ad esempio, questo saggio di FABP4 fornisce un semplice metodo per il confronto tra tutte queste variabili e il potenziale per valutare i risultati terapeutici all’interno e tra studi clinici.
La quantificazione di FABP4 in modo semi-automatico consente di obiettività e riproducibilità in analisi attraverso molti esempi e casi di donatore. Inoltre come l’etichetta è citoplasmatica, che potenzialmente può essere utilizzato per analizzare l’ipertrofia (ingrossamento della dimensione degli adipociti) oltre a iperplasia (aumento di numero degli adipociti), una distinzione che riveste una notevole importanza nella ricerca di obesità, dove l’ipertrofia è fortemente associato con disfunzione adiposa in individui obesi21. L’epidemia dell’obesità ha stimolato una notevole quantità di interesse nell’identificazione di farmaci in grado di controllare l’immagazzinaggio del lipido. Questo test di FABP4 fornisce anche una lettura semplice per lo screening di migliaia di composti per la loro capacità di inibire l’accumulo di lipidi.
The authors have nothing to disclose.
Siamo grati ai donatori di tessuti adiposi e i professionisti di ricerca che raccolgono e forniscono questa risorsa a noi per uso di ricerca. Vorremmo riconoscere finanziamento da Allergan. Saremo grati anche per l’Università di Auckland, facoltà di medicina e salute Scienze Performance Based Research Fund per finanziare i costi di ripresa e di editing per la presentazione di questo articolo.
Tris Base | Invitrogen | 15504-020 | Tris buffered saline |
Sodium Chloride | Merck | 1064041000 | Tris buffered saline |
Potassium Chloride | Merck | 1049360500 | Tris buffered saline |
Sodium Azide | Scharlau | SO0091 | Casein blocker solution |
Casein | Sigma | C7078-500G | Casein blocker solution |
PBS tablet | Sigma | P4417-100TAB | Phosphate buffered saline |
DMEM/F12 | Gibco | 11330-032 | Cell culture |
Penicillin/streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | Cell culture |
Glutamax | Gibco | 35050-061 | Cell culture |
Fetal bovine serum | Gibco | 10091-148 | Cell culture |
TrypLE Select Enzyme (1X), no phenol red | Gibco | 12563-029 | Cell dissociation enzyme |
96 well plate (flat bottom) | Falcon | FAL353072 | Cell culture equipment |
T75 culture flask, with filter cap | Greiner | 658175 | Cell culture equipment |
Insulin | Sigma | 19278-5ML | Adipogenic differentiation media |
dexamethasone | Sigma | D2915-100MG | Adipogenic differentiation media |
indomethacin | sigma | I7378-5G | Adipogenic differentiation media |
Oil-Red O | Sigma | O-0625 | Classic stain for adipogenesis |
Isopropanol | Merck | 1.09634 | Classic stain for adipogenesis |
16% formaldehyde | Pierce | 28908 | Cell fixation |
Acetone | Merck | 100983 | Cell fixation |
DAPI | Sigma | D9542 | Immunocytochemistry |
Anti rabbit IgG alexa 488 | Molecular Probes | A11008 | Immunocytochemistry |
Thimerosal | Sigma | T5125-10G | Immunocytochemistry |
Rabbit anti-human fatty acid binding protein 4 (FABP4) antibody | Cayman Chemicals | 10004944 | Marker of adipogenesis |
Centrifuge tubes (15mL) | Greiner | GR188271 | General |
Centrifuge tubes (50mL) | Greiner | GR227261-P | General |
ImageXpress Micro XLS | Molecular Devices | high content screening machine | |
MetaXpress | Molecular Devices | high content screening software, version 5.4.01 |