概要

의 Zebrafish의 애벌레 모델의 선천성 면역 반응의 비 침습적 영상<em> 연쇄상 구균 iniae</em> 감염

Published: April 21, 2015
doi:

概要

Here, we present a protocol for the generation and imaging of a localized bacterial infection in the zebrafish otic vesicle.

Abstract

수생 병원균, 연쇄상 구균 iniae은 양식 산업의 연간 손실이 1 억 달러 이상을 담당하고 물고기와 인간 모두에서 전신 질환을 야기 할 수있다. S.의 이해 iniae 질환 발병 적절한 모델 시스템이 필요합니다. 형광 면역 세포를 태그와 함께 유전의 취급 용이성 및 제브라 피쉬의 초기 발달 단계의 광학 투명성이 유전자 변형 라인의 생성과 비 침습 이미징 할 수 있습니다. 몇 주 수정을 게시 할 때까지 적응 면역 시스템이 정상적으로 작동하지 않습니다,하지만 제브라 피쉬의 유충은 호중구와 대 식세포 모두 보존 된 척추 동물의 선천성 면역 시스템을 가지고있다. 따라서, 유충 감염 모델의 생성을 제어 S. 선천성 면역의 특정 공헌 연구를 허용 iniae 감염.

미세 주입의 사이트는 감염 여부를 확인할 수 있습니다전신 또는 처음 지역화. 여기서 우리는 귀의 소포 제브라 피쉬 세 2~3일 게시물 수정의 주입뿐만 아니라 감염의 형광 공 초점 영상에 대한 우리의 기술에 대한 우리의 프로토콜을 제시한다. 지역화 감염 사이트는 초기 미생물의 침략의 관찰, 숙주 세포의 모집 및 감염의 보급을 할 수 있습니다. S.의 제브라 피쉬 애벌레 모델을 사용하여 우리의 연구 결과 iniae 감염 지브라 피쉬 지역화 세균 감염에 호스트 호중구 및 대 식세포의 상이한 기여를 조사하는데 사용될 수 있다는 것을 나타낸다. 또한, 우리는 면역 세포 photolabeling 감염 과정 동안 개별 숙주 세포의 운명을 추적 할 수있는 방법을 설명한다.

Introduction

스트렙토 iniae 물고기와 인간 모두에서 1 전신 질환을 야기 할 수있는 큰 수생 병원체이다. S. 동안 iniae은 양식업에 큰 손실을 책임지고 또한 다른 구균 인간 병원체에 의해 발생 된 것과 유사한 임상 병리 호스트 인간 면역 질병을 일으킬 수있는 잠재적 인 동물 매개 병원체이다. 인간의 병원체와의 유사성을 감안할 때, 그것은 S.을 연구하는 것이 중요하다 자연 숙주의 맥락에서 iniae 질환 발병. 미국의 성인 제브라 피쉬 모델 iniae 감염은 감염의 지역화 된 사이트뿐만 아니라 죽음을 호스팅 할 빠른 시간에 호스트 백혈구의 강력한 침투를 밝혀, 너무 짧은 시간은 적응 면역 시스템 (7)을 포함합니다. 얻기 위해 심도 S.에 대한 선천성 면역 반응을 조사 생체 내에서 감염 iniae, 그것은 N 더 의무가 모델을 사용할 필요가있다에 침습 라이브 영상.

유생 지브라 피쉬는 호스트 병원체 상호 작용을 연구하는데 더욱 매력적인 척추 동물 모델 만드는 장점을 가진다. Zebrafish의 사용 및 포유 동물 모델에 비해 유지 보수가 상대적으로 저렴하고 쉽습니다. 적응 면역 4-6 주 후 수정까지 기능적으로 성숙이 아니라 애벌레 식균 작용 및 호흡기 버스트 2-6을 포함하여 항균 기능을 보완, 수신자 같은 수용체, 사이토 카인, 호중구와 대 식세포와 고도의 보존 척추 동물의 선천성 면역 시스템을 가지고, 8-11. 또한, 취급 용이성 및 유전 배아 발달 및 유생의 광학적 투명도와 형광 표지 된 면역 세포가 생체 내에서 가능한 실시간 호스트 병원체 상호 작용을 조사 할 수있게 안정적으로 형질 전환 계통의 생성을 허용한다. 같은 덴 같은 photoconvertible 단백질을 사용하여 이러한 유전자 변형 라인의 세대dra2 감염 (12)의 과정을 통해 개별 숙주 세포의 기원과 운명의 추적 할 수 있습니다.

제브라 피쉬의 유충 감염 모델을 개발하는 경우, 미세 주입의 선택이 사이트는 감염 초기에 지역화 또는 전신 여부를 확인할 수 있습니다. 꼬리 정맥 또는 퀴비에의 덕트로 전신 혈액 감염은 가장 일반적으로 제브라 피쉬의 미생물 병원체를 연구하는 데 사용 및 병원체 균주 사이의 독​​성에 호스트와 미생물 세포, 사이토 카인 응답 및 차이 사이의 상호 작용을 연구하는 데 유용합니다. 느리게 성장하는 미생물, 16-1,000 세포 단계에서 배아 난황낭에 이른 주입 사이 인 것으로 밝혀 느리게 성장하는 미생물의 마이크로 인젝션 최적 발달 단계와, 전신 감염 13,14을 생성하기 위해 사용될 수있다 16-128 세포 단계 (15). 그러나 호스트 개발 후기 단계에서 많은 미생물의 주머니 주사 노른자는 t에 치명적인 경향이있다그는 백혈구 16-18 침투의 미생물 및 부족에 대한 영양이 풍부한 환경으로 인해 호스트.

국소 감염은 일반적으로 쉽게 비 침습성 영상화로 정량화 할 수있다 감염 부위쪽으로 향하는 백혈구 이동을 초래한다. 감염이 유형의 백혈구 이동뿐만 아니라 다양한 백혈구 집단의 상이한 이동성 및 포식성 조사 기능을 중재 메커니즘의 절개를 허용 할 수있다. 균주 사이의 독​​성의 차이를 검사뿐만 아니라 물리적 호스트 장벽이 전신이 될 지역화 감염에 대한 교차해야하기 때문에 미생물의 침입 메커니즘을 연구 할 때 현지화 감염도 유용하다. 제브라 피쉬는 전형적 25-31 °의 C (19)의 온도로 승온되어 있지만, 그들은 또한 엄격한 온도 요구와 인간의 특정 병원균의 침입에 대한 연구의 34 ~ 35 ° C의 높은 온도에서 유지 될 수있다독성 20, 21.

많은 다른 사이트 후뇌 심실 22, 꼬리 지느러미 근육 18 심낭 캐비티 (23), 및 귀의 소포 (EAR) 5, 16, 24을 포함한 국소 초기 세균 감염을 생성하는데 사용되어왔다. 그러나, 백혈구 응답 (13)을 조사 할 때 결과를 왜곡 할 수있다 박테리아의 조직 손상과 염증의 독립을 일으킬 수 있습니다 꼬리 근육에 박테리아의 주입을 발견되었습니다. 덜 손상은 후뇌로 주입과 관련된하고 젊은 배아에 백혈구의 초기없는 있지만 미세 아교 세포가 거주를 골라, 후뇌 심실 꾸준히 시간이 지남에 따라 더 많은 면역 세포를 얻게되지만. 후뇌 심실 또한 이미지에 더 어려운 위치입니다. 귀의 소포는 혈관 (25), (26)에 직접 액세스 할 수있는 폐쇄 중공 캐비티입니다. 그것은 레우의 일반적없는 것입니다kocytes하지만 백혈구 감염 같은 염증성 자극에 반응하여 귀의 소포에 채용 될 수있다. 또한 때문에 영상의 용이성과 주입의 시각화 제브라 피쉬 세 2-3일 포스트 수정 (DPF) 박테리아의 미세 주입의 바람직한 사이트입니다. 따라서, 우리는 지역화 된 세균 감염의 사이트로 귀의 소포를 선택했다.

Protocol

성인 및 배아 제브라 피쉬는 위스콘신 – 매디슨 연구 동물 자원 센터의 대학에 따라 유지했다. 1. 미세 주입 바늘을 준비 손잡이 (5), 방송 시간의 시작에서, 속도 (80), 시간 (70), 대기 시간, 공기 압력 (200), 열 (502) (90)를 당겨 : 다음 설정을 마이크로 피펫 풀러 장치를 이용하여 얇은 벽 유리 모세관 주입 바늘 (1.0 OD / 0.75 ID)를 준비 풀 5의 끝에서. 선단 개구는 약 10…

Representative Results

S.의 미세 주입 처음 지역화 된 호스트 응답에 귀의 소포로 iniae (그림 1과 그림 2) 결과. 정확하게 주입되면, 세균은 귀의 소포에 아닌 주변 조직 또는 혈액으로 이해되어야한다. 이는 페놀 적색 염료를 (도 1a)를 사용하여 마이크로 인젝션 중에 가시화 될 수있다. 레이블이 박테리아가 주입되는 경우 또는 감염 유충의 빠른 검사는 즉시 박테리아는 귀의 소포에…

Discussion

여기에 사용되는 감염 경로는 2-3 DPF 배아 및 유충의 초기에 국소 감염에 대한 숙주 면역 반응의 연구에 유용합니다. 이러한 귀의 소포와 같은 밀폐 된 공동의 감염으로 염증 자극,의 초점은 호중구와 대 식세포 화성과 식균 작용의 연구에 있습니다. 귀의 소포에 박테리아를 주입 한 가지주의 할 점은 호중구의 기능을 효율적으로 유체로 채워진 공동의 탐식 박테리아가 특정 미생물에 의존 할 수있…

開示

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

저자는 제브라 피쉬의 관리 및 유지 보수에 대한 실험실 구성원에게 감사의 말씀을 전합니다. 이 작품은 국립 보건원, EA 하비에 국가 연구 서비스 상 A155397 안나 Huttenlocher에 NIH R01GM074827에 의해 지원되었다.

Materials

1.7 ml eppendorfs MidSci AVSS1700
14 ml falcon tube BD Falcon 352059
27 G x 1/2 in. needle BD Biosciences 305109
96 well plate Corning Incorporated 3596
Agar BD Biosciences 214030
CellTracker Red Molecular Probes, Invitrogen C34552
CNA agar Dot Scientific, Inc 7126A
Disposable transfer pipets Fisher Scientific 13-711-7m
Dissecting Scope Nikon SMZ745
DMSO Sigma Aldrich D2650
Ethanol 200 proof MDS 2292
Fine tweezers Fine Science Tools 11251-20
Gel comb VWR 27372-482 4.2 mm width, 1.5 mm thick
Glass bottom dishes Custom made by drilling a 16–18 mm hole in the center of a 35-mm tissue culture dish bottom and placing a 22-mm round #1 coverslip in the hole and sealing with a thin layer of Norland Optical Adhesive 68 cured by UV light.
Glycerol Fisher Scientific G33-4
High melt agarose Denville Scientific, Inc. CA3510-6
Hydrogen peroxide Fisher Scientific H325
Laser Scanning Confocal Microscope Olympus with FV-1000 system
Low melt agarose Fisher BP165-25
Magnetic stand Tritech (Narishige) GJ-1
Microinjection system Parker Picospritzer III
Microloader pipet tips Eppendorf 930001007
Micromanipulator Tritech (Narishige) M-152
Micropipette puller Sutter Instrument Company Flaming/Brown P-97
Nanodrop spectrophotmeter Thermo Scientific ND-1000
N-Phenylthiourea (PTU) Sigma aldrich P7629
Paraformaldheyde Electron Microscopy Sciences 15710
Petri Dishes Fisher Scientific FB0875712 100 mm x 15 mm
Phenol Sigma Aldrich P-4557
Phenol Red Ricca Chemoical Company 572516
Phosphate Buffered Saline Fisher Scientific BP665-1
Potassium hydroxide Sigma Aldrich P-6310
Pronase Roche 165921
Protease peptone Fluka Biochemika 29185
Small cell culture dish Corning Incorporated 430165 35 mm x 10 mm
Sudan Black Sigma Aldrich S2380
Thin wall glass capillary injection needles World Precision Instruments, Inc. TW100-3
Todd Hewitt Sigma Aldrich/Fluka Analytical T1438
Tricaine (ethyl 3-aminobenzoate) Argent Chemical Laboratory/Finquel C-FINQ-UE-100G
Triton X-100 Fisher Scientific BP151-500
Tween 20 Fisher Scientific BP337-500
Yeast extract Fluka Biochemika 92144

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記事を引用
Harvie, E. A., Huttenlocher, A. Non-invasive Imaging of the Innate Immune Response in a Zebrafish Larval Model of Streptococcus iniae Infection. J. Vis. Exp. (98), e52788, doi:10.3791/52788 (2015).

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