概要

הדמיה לא פולשנית של התגובה החיסונית המולדת בדגם דג הזברה הזחל של<em> Streptococcus iniae</em> זיהום

Published: April 21, 2015
doi:

概要

Here, we present a protocol for the generation and imaging of a localized bacterial infection in the zebrafish otic vesicle.

Abstract

הפתוגן המימי, Streptococcus iniae, אחראי ליותר מ -100 מיליון דולרים בהפסדים שנתי לתעשיית החקלאות הימית ומסוגל לגרום למחלה מערכתית בשני דגים ובני אדם. הבנה טובה יותר של ס ' היווצרות המחלה iniae דורשת מערכת מודל מתאימה. נְהִילוּת הגנטית והשקיפות האופטית של שלבי התפתחות המוקדמים של דג הזברה מאפשרות ההדמיה הדור ולא פולשנית של קווים מהונדסים עם fluorescently מתויג תאי מערכת חיסון. המערכת החיסונית אדפטיבית אינה מתפקדת באופן מלא עד מספר שבועות לאחר הפריה, אבל יש לי זחלי דג הזברה מערכת חיסון מולדת חוליות נשמרים עם שני נויטרופילים ומקרופגים. כך, הדור של מודל זיהום זחל מאפשר הלימוד של התרומה הספציפית של מערכת חיסון מולדת בשליטה S. זיהום iniae.

האתר של microinjection יקבע אם זיהום הואמערכתי או מקומי בתחילה. כאן, אנו מציגים הפרוטוקולים שלנו להזרקת otic שלפוחית ​​של 2-3 ימים לאחר הפריה בגיל דג הזברה, כמו גם הטכניקות שלנו להדמית confocal ניאון של זיהום. אתר זיהום מקומי מאפשר תצפית של פלישת חיידק ראשונית, גיוס של תאי מארח והפצה של זיהום. הממצאים שלנו תוך שימוש במודל זחל דג הזברה של ס ' זיהום iniae מצביע על כך שדג זברה יכולה לשמש כדי לבחון את התרומות השונות של נויטרופילים ומקרופגים מארח בזיהומים חיידקיים מקומיים. בנוסף, אנו מתארים כיצד photolabeling של תאי מערכת חיסון יכול לשמש כדי לעקוב אחר גורל תא מארח בודד במהלך הזיהום.

Introduction

Streptococcus iniae הוא פתוגן המימי גדול, כי הוא מסוגל לגרום למחלות מערכתיות בשני דגים ובני אדם 1. בעוד ש ' iniae אחראי להפסדים גדולים בתעשיית החקלאות הימית, הוא גם פתוגן zoonotic פוטנציאלי, מסוגל לגרום למחלה באדם מארחי מדוכאי חיסון עם פתולוגיות קליניות דומות לאלו הנגרמים על ידי פתוגנים אנושיים סטרפטוקוקלי אחרים. בהתחשב בדמיון שלה עם פתוגנים אנושיים, חשוב ללמוד S. היווצרות המחלה iniae בהקשר של מארח טבעי. מודל דג הזברה מבוגרת של ס ' זיהום iniae חשף חדירה חזקה של לויקוציטים מארח לאתר המקומי של זיהום, כמו גם זמן מהיר לארח מוות, זמן קצר מדי כדי לערב את המערכת החיסונית אדפטיבית 7. כדי לזכות במבט מעמיק לתוך התגובה החיסונית המולדת S. iniae זיהום in vivo, יש צורך להשתמש במודל שהוא יותר נוח לnעל-פולשני הדמיה לחיות.

יש דג הזברה הזחל מספר היתרונות שהופכים אותו מודל חוליות אטרקטיבי יותר ויותר ללימוד אינטראקציות מארח הפתוגן. דג הזברה היא יחסית זולה וקלים לשימוש ולתחזוקה בהשוואה לדגמים של יונקים. החסינות מסתגלת היא לא פונקציונלי בוגרת עד 4-6 שבועות לאחר הפריה, אבל יש לי זחלי מערכת חיסון מולדת חוליות השמורות ביותר עם ​​השלמה, Toll-like receptors, ציטוקינים, ונויטרופילים ומקרופגים עם יכולות מיקרוביאלית כולל phagocytosis ופרץ הנשימה 2-6, 8-11. בנוסף, נְהִילוּת הגנטית והשקיפות אופטית של השלבים העובריים וזחל של פיתוח לאפשר לדור של קווים מהונדסים יציבים עם תאים חיסוניים שכותרתו fluorescently כך שניתן לבחון אינטראקציות מארח הפתוגן בזמן אמת in vivo. הדור של קווים מהונדסים אלה באמצעות חלבון photoconvertible כגון Dendra2 מאפשר מעקב ממוצא תא מארח וגורל אדם במהלך הזיהום 12.

בעת פיתוח מודל זיהום זחל דג הזברה, האתר הנבחר של microinjection יקבע אם זיהום הוא בתחילה מקומי או מערכתי. זיהומי דם מערכתיים לוריד הזנב או Duct של קיביה הם נפוצים ביותר ללמוד פתוגנים חיידקים בדג זברה ושימושיים לחקר אינטראקציות בין מארח ותאי חיידקים, תגובות ציטוקינים, והבדלים בארסיות בין זני הפתוגן. למיקרואורגניזמים צומחים לאט יותר, הזרקה מוקדם לצק החלמון של עובר בשלב 16-1,000 התא יכולה לשמש כדי ליצור זיהום מערכתי 13,14, עם השלב ההתפתחותי האופטימלי עבור microinjection של מיקרואורגניזם גדל לאט מצא להיות בין שלב 16-128 תא 15. עם זאת, חלמון זריקות שק של חיידקים רבים בשלבים מאוחר יותר של התפתחות מארח נוטה להיות קטלני לtהוא יארח בשל הסביבה עשירה בחומרים המזינים לחיידקים וחוסר חדירה לויקוציטים 16-18.

זיהום מקומי גורם בדרך כלל להגירה בבימויו של לויקוציטים לאתר של זיהום שניתן לכמת בקלות עם הדמיה לא פולשנית. סוג זה של זיהום יכול לאפשר לנתיחה של המנגנונים אשר מתווכים הגירה לויקוציטים, כמו גם חקירה של יכולות נדידה וphagocytic שונות של אוכלוסיות שונות לויקוציטים. זיהומים מקומיים שימושיים גם כאשר בוחנים הבדלים בארסיות בין זני חיידקים, כמו גם לימוד מנגנוני פלישת חיידק מאז מחסומי מארח פיזיים צריכים לעבור לזיהום מקומי להפוך מערכתי. דג הזברה גדלות בדרך כלל בטמפרטורות של C ° 25-31 19, אבל הם גם יכולים להישמר בטמפרטורות גבוהות ככל C ° 34-35 ללימודים של הפולשנות של פתוגנים אנושיים מסוימים עם דרישות קפדניות טמפרטורהלארסיות 20, 21.

אתרים רבים ושונים המשמשים ליצירת זיהום חיידקים בתחילה מקומי כוללים החדר למוח האחורי 22, שרירים גב זנב 18, חלל קרום הלב 23, ושלפוחית ​​otic (אוזן) 5, 16, 24. עם זאת, זה כבר נמצא הזרקה של חיידקים לתוך שריר זנב יכול לגרום נזק לרקמות ועצמאי דלקת של החיידקים, שעלול להטות את תוצאות כאשר חוקרים תגובה לויקוציטים 13. למרות שפחות נזק קשור להזרקה למוח האחורי ולמרות שזה בהתחלה נטול לויקוציטים בעוברים צעירים, החדר למוח האחורי בהתמדה זוכה תאים חיסוניים יותר לאורך זמן כמו מיקרוגליה להשתכן. החדר למוח האחורי הוא גם מיקום קשה יותר לתמונה. שלפוחית ​​otic היא חלל חלול סגור ללא גישה ישירה למערכת כלי הדם 25, 26. זה בדרך כלל נטול Leukocytes, אבל leukocytes ניתן לגייס לשלפוחית ​​otic בתגובה לגירויים דלקתיים כגון דלקת. כמו כן, אתר מועדף של microinjection של חיידקים בתוך 2-3 ימים לאחר הפריה דג הזברה גיל (DPF) בגלל הקלות של הדמיה ויזואליזציה של ההזרקה. לכן, בחרנו שלפוחית ​​otic כאתר של זיהום חיידקים המקומי שלנו.

Protocol

דג הזברה מבוגר והעוברי נשמרה בהתאם לאוניברסיטה ויסקונסין-מדיסון מחקר משאבי בעלי החיים המרכז. 1. הכנת Microinjection מחטים הכן מחטים דק קיר הזרקת נימי זכוכית (OD 1.0 / 0.75 ID) באמצעות מכשיר חולץ…

Representative Results

Microinjection של ס ' תוצאות iniae לתוך שלפוחית ​​otic (איור 1 ואיור 2) בתגובת מארח תחילה מקומית. כאשר הוא מוזרק בצורה נכונה, יש לראות את החיידקים רק בשלפוחית ​​otic ולא ברקמה או דם שמסביב. זה יכול להיות דמיין במהלך microinjection באמצעות צבע אדום פנול (איור 1 א).</str…

Discussion

שיטת ההדבקה משמשת כאן היא שימושית עבור המחקר של התגובה החיסונית המארח לזיהום בתחילה מקומי ב2-3 עוברים וזחלי DPF. מוקד גירוי דלקתי, כגון זיהום, בחלל סגור כגון שלפוחית ​​otic מאפשר לחקר chemotaxis נויטרופילים ומקרופאג וphagocytosis. אזהרה אחת של הזרקת חיידקים לתוך שלפוחית ​​otic היא ?…

開示

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

המחברים מבקשים להודות לחברי מעבדה לטיפול ותחזוקה של דג הזברה. עבודה זו נתמכה על ידי המכונים לאומי לבריאות, שירות הלאומי לחקר פרס A155397 לEA Harvie וNIH R01GM074827 לאנה Huttenlocher.

Materials

1.7 ml eppendorfs MidSci AVSS1700
14 ml falcon tube BD Falcon 352059
27 G x 1/2 in. needle BD Biosciences 305109
96 well plate Corning Incorporated 3596
Agar BD Biosciences 214030
CellTracker Red Molecular Probes, Invitrogen C34552
CNA agar Dot Scientific, Inc 7126A
Disposable transfer pipets Fisher Scientific 13-711-7m
Dissecting Scope Nikon SMZ745
DMSO Sigma Aldrich D2650
Ethanol 200 proof MDS 2292
Fine tweezers Fine Science Tools 11251-20
Gel comb VWR 27372-482 4.2 mm width, 1.5 mm thick
Glass bottom dishes Custom made by drilling a 16–18 mm hole in the center of a 35-mm tissue culture dish bottom and placing a 22-mm round #1 coverslip in the hole and sealing with a thin layer of Norland Optical Adhesive 68 cured by UV light.
Glycerol Fisher Scientific G33-4
High melt agarose Denville Scientific, Inc. CA3510-6
Hydrogen peroxide Fisher Scientific H325
Laser Scanning Confocal Microscope Olympus with FV-1000 system
Low melt agarose Fisher BP165-25
Magnetic stand Tritech (Narishige) GJ-1
Microinjection system Parker Picospritzer III
Microloader pipet tips Eppendorf 930001007
Micromanipulator Tritech (Narishige) M-152
Micropipette puller Sutter Instrument Company Flaming/Brown P-97
Nanodrop spectrophotmeter Thermo Scientific ND-1000
N-Phenylthiourea (PTU) Sigma aldrich P7629
Paraformaldheyde Electron Microscopy Sciences 15710
Petri Dishes Fisher Scientific FB0875712 100 mm x 15 mm
Phenol Sigma Aldrich P-4557
Phenol Red Ricca Chemoical Company 572516
Phosphate Buffered Saline Fisher Scientific BP665-1
Potassium hydroxide Sigma Aldrich P-6310
Pronase Roche 165921
Protease peptone Fluka Biochemika 29185
Small cell culture dish Corning Incorporated 430165 35 mm x 10 mm
Sudan Black Sigma Aldrich S2380
Thin wall glass capillary injection needles World Precision Instruments, Inc. TW100-3
Todd Hewitt Sigma Aldrich/Fluka Analytical T1438
Tricaine (ethyl 3-aminobenzoate) Argent Chemical Laboratory/Finquel C-FINQ-UE-100G
Triton X-100 Fisher Scientific BP151-500
Tween 20 Fisher Scientific BP337-500
Yeast extract Fluka Biochemika 92144

参考文献

  1. Agnew, W., Barnes, A. C. Streptococcus iniae: An aquatic pathogen of global veterinary significance and a challenging candidate for reliable vaccination. Vet. Microbiol. 122 (1-2), 1-15 (2007).
  2. Danilova, N., Steiner, L. A. B cells develop in the zebrafish pancreas. Proc. Natl. Acad. Sci. 99, 13711-13716 (2002).
  3. Lam, S. H., Chua, H. L., Gong, Z., Lam, T. J., Sin, Y. M. Development and maturation of the immune system in zebrafish, Danio rerio: a gene expression profiling, in situ hybridization and immunological study. Dev. Comp. Immunol. 28 (1), 9-28 (2004).
  4. Willett, C. E., Cortes, A., Zuasti, A., Zapata, A. Early Hematopoiesis and Developing Lymphoid Organs in the Zebrafish. Dev. Dyn. 214, 323-336 (1999).
  5. Le Guyader, D., et al. Origins and unconventional behavior of neutrophils in developing zebrafish. Blood. 111 (1), 132-141 (2008).
  6. Herbomel, P., Thisse, B., Thisse, C. Ontogeny and behaviour of early macrophages in the zebrafish embryo. Development(Cambridge, England). 126 (17), 3735-3745 (1999).
  7. Neely, M. N., Pfeifer, J. D., Caparon, M. G. Streptococcus-Zebrafish Model of Bacterial Pathogenesis. Infect. Immun. 70 (7), 3904-3914 (2002).
  8. Jault, C., Pichon, L., Chluba, J. Toll-like receptor gene family and TIR-domain adapters in Danio rerio. Mol. Immunol. 40 (11), 759-771 (2004).
  9. Meijer, A. H., et al. Expression analysis of the Toll-like receptor and TIR domain adaptor families of zebrafish. Mol. immunol. 40 (11), 773-783 (2004).
  10. Seeger, A., Mayer, W. E., Klein, J. A Complement Factor B-Like cDNA clone from the Zebrafish (Brachydanio rerio). Mol. immunol. 33, 511-520 (1996).
  11. Hermann, A. C., Millard, P. J., Blake, S. L., Kim, C. H. Development of a respiratory burst assay using zebrafish kidneys and embryos. J. Immunol. Methods. 292 (1-2), 119-129 (2004).
  12. Yoo, S. K., Huttenlocher, A. Spatiotemporal photolabeling of neutrophil trafficking during inflammation in live zebrafish. J. Leukoc. Biol. 89 (5), 661-667 (2011).
  13. Benard, E. L., et al. Infection of Zebrafish Embryos with Intracellular Bacterial Pathogens. J. Vis. Exp. , 1-9 (2012).
  14. Carvalho, R., et al. A High-Throughput Screen for Tuberculosis Progression. PLoS ONE. 6 (2), e16779 (2011).
  15. Veneman, W. J., Marín-Juez, R., et al. Establishment and Optimization of a High Throughput Setup to Study Staphylococcus epidermidis and Mycobacterium marinum Infection as a Model for Drug Discovery. J. Vis. Exp. (88), (2014).
  16. Deng, Q., Harvie, E. A., Huttenlocher, A. Distinct signaling mechanisms mediate neutrophil attraction to bacterial infection and tissue injury. Cell. Microbiol. , (2012).
  17. Sar, A. M., et al. Zebrafish embryos as a model host for the real time analysis of Salmonella typhimurium infections. Cell. Microbiol. 5 (9), 601-611 (2003).
  18. Lin, A., Loughman, J. A., Zinselmeyer, B. H., Miller, M. J., Caparon, M. G. Streptolysin S Inhibits Neutrophil Recruitment during the Early Stages of Streptococcus pyogenes Infection. Infect. Immun. 77 (11), 5190-5201 (2009).
  19. Volhard, C., Dahm, R. . Zebrafish: A Practical Approach. , (2002).
  20. He, S., et al. Neutrophil-mediated experimental metastasis is enhanced by VEGFR inhibition in a zebrafish xenograft model. J. Pathol. 227 (4), 431-445 (2012).
  21. Haldi, M., Ton, C., Seng, W. L., McGrath, P. Human melanoma cells transplanted into zebrafish proliferate, migrate, produce melanin, form masses and stimulate angiogenesis in zebrafish. Angiogenesis. 9 (9), 139-151 (2006).
  22. Davis, J. M., et al. Real-time visualization of mycobacterium-macrophage interactions leading to initiation of granuloma formation in zebrafish embryos. Immunity. 17 (6), 693-702 (2002).
  23. Wiles, T. J., Bower, J. M., Redd, M. J., Mulvey, M. A. Use of Zebrafish to Probe the Divergent Virulence Potentials and Toxin Requirements of Extraintestinal Pathogenic Escherichia coli. PLoS Pathog. 5 (12), e1000697 (2009).
  24. Harvie, E. A., Green, J. M., Neely, M. N., Huttenlocher, A. Innate Immune Response to Streptococcus iniae Infection in Zebrafish Larvae. Infect. Immun. 81 (1), 110-121 (2013).
  25. Haddon, C., Lewis, J. Early Ear Development in the Embryo of the Zebrafish, Danio rerio. J. Comp. Neurol. 365, 113-128 (1996).
  26. Whitfield, T. T., Riley, B. B., Chiang, M. -. Y., Phillips, B. Development of the zebrafish inner ear. Dev. Dyn. 223 (4), 427-458 (2002).
  27. Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function. J. Vis. Exp. (25), (2009).
  28. Colucci-Guyon, E., Tinevez, J. Y., Renshaw, S. A., Herbomel, P. Strategies of professional phagocytes in vivo: unlike macrophages, neutrophils engulf only surface-associated microbes. J. Cell Sci. 124 (18), 3053-3059 (2011).
  29. Gurskaya, N. G., et al. Engineering of a monomeric green-to-red photoactivatable fluorescent protein induced by blue light. Nat. Biotechnol. 24 (4), 461-465 (2006).
  30. Deng, Q., et al. Localized bacterial infection induces systemic activation of neutrophils through Cxcr2 signaling in zebrafish. J. Leukoc. Biol. 93 (5), 761-769 (2013).

Play Video

記事を引用
Harvie, E. A., Huttenlocher, A. Non-invasive Imaging of the Innate Immune Response in a Zebrafish Larval Model of Streptococcus iniae Infection. J. Vis. Exp. (98), e52788, doi:10.3791/52788 (2015).

View Video