概要

التصوير غير الغازية من الاستجابة المناعية الفطرية في نموذج الزرد يرقات<em> العقدية iniae</em> العدوى

Published: April 21, 2015
doi:

概要

Here, we present a protocol for the generation and imaging of a localized bacterial infection in the zebrafish otic vesicle.

Abstract

الممرض المائية، العقدية iniae، هي المسؤولة عن أكثر من 100 مليون دولار في خسائر سنوية لصناعة تربية الأحياء المائية، وقادر على التسبب في أمراض جهازية في كل من الأسماك والبشر. فهم أفضل للS. يتطلب iniae المرض والتسبب في نظام النموذج المناسب. وقابلية الإستطراق الجيني والشفافية البصرية من مراحل النمو المبكرة من الزرد تسمح لتوليد وغير الغازية التصوير من خطوط المعدلة وراثيا مع الموسومة fluorescently الخلايا المناعية. جهاز المناعة التكيفية ليست وظيفية بالكامل حتى عدة أسابيع بعد الإخصاب، ولكن اليرقات الزرد لديها الفقاريات المحفوظة نظام المناعة الفطري مع كل من العدلات والضامة. وهكذا، وتوليد نموذج العدوى اليرقات يسمح دراسة مساهمة محددة الحصانة الفطرية في السيطرة S. عدوى iniae.

سوف موقع حقن مكروي تحديد ما إذا كان وجود عدوى هوالنظامية أو محلية في البداية. هنا، نقدم بروتوكولات لدينا أذني حقن حويصلة من الزرد الذين تتراوح أعمارهم بين 2-3 أيام الإخصاب آخر فضلا عن تقنيات لدينا لتصوير مبائر الفلورسنت من العدوى. موقع عدوى موضعية يسمح مراقبة غزو ميكروب الأولي، وتجنيد الخلايا المضيفة ونشر العدوى. النتائج التي توصلنا إليها باستخدام نموذج اليرقات الزرد من S. عدوى iniae تشير إلى أن الزرد يمكن استخدامها لدراسة مساهمات مختلفة من العدلات المضيفة والضامة في الالتهابات البكتيرية المحلية. وبالإضافة إلى ذلك، نحن تصف كيف يمكن استخدام photolabeling من الخلايا المناعية لتعقب المضيف فرد مصير خلية أثناء العدوى.

Introduction

العقدية iniae هو الممرض المائية الكبرى التي هي قادرة على التسبب في أمراض جهازية في كل من الأسماك والبشر 1. في حين S. iniae مسؤولة عن خسائر كبيرة في صناعة تربية الأحياء المائية، وإنما هو أيضا الممرض الحيوانية المحتملين، القادرة على إحداث أمراض في المضيف البشري المناعة مع الأمراض السريرية مشابهة لتلك التي تسببها أخرى مسببات الأمراض البشرية العقديات. ونظرا التشابه مع مسببات الأمراض البشرية، فمن المهم دراسة S. iniae المرض والتسبب في سياق مجموعة الطبيعي. نموذج الزرد الكبار من S. وكشف العدوى iniae تسلل قوي من الكريات البيض المضيف الى الموقع المترجمة من العدوى وكذلك وقت سريع لاستضافة الموت، وهو وقت قصير جدا لإشراك جهاز المناعة التكيفية 7. من اجل الحصول على نظرة متعمقة في الاستجابة المناعية الفطرية للS. iniae العدوى في الجسم الحي، فمن الضروري استخدام النموذج الذي هو أكثر قابلية لنعلى الغازية التصوير الحي.

الزرد اليرقات لديها عدد من المزايا التي تجعل من نموذج الفقاريات جذابة على نحو متزايد لدراسة التفاعلات المضيف الممرض. الزرد غير مكلفة نسبيا وسهلة الاستخدام والحفاظ مقارنة نماذج الثدييات. الحصانة التكيف ليست ناضجة وظيفيا حتى 4-6 أسابيع الإخصاب آخر، ولكن اليرقات لها الفقاريات حفظا للغاية نظام المناعة الفطري مع تكملة، تول مثل مستقبلات، السيتوكينات، والعدلات والضامة مع قدرات مضادة للميكروبات بما في ذلك البلعمة وانفجر الجهاز التنفسي 2-6، 8-11. وبالإضافة إلى ذلك، فإن قابلية الإستطراق الجيني والشفافية البصرية من المراحل الجنينية واليرقات للتنمية تسمح لتوليد خطوط المعدلة وراثيا مستقرة مع الخلايا المناعية fluorescently المسمى مما يجعل من الممكن لدراسة التفاعلات المضيف الممرض في الوقت الحقيقي في الجسم الحي. جيل من هذه خطوط المعدلة وراثيا باستخدام البروتين photoconvertible مثل دنdra2 يسمح لتتبع الفردي أصل الخلية المضيفة ومصير على مدار 12 إصابة.

عند وضع الزرد نموذج عدوى اليرقات، فإن الموقع المختار لحقن مكروي تحديد ما إذا كان وجود عدوى هو في البداية موضعية أو جهازية. وتستخدم الالتهابات الجهازية الدم في الوريد الذيلية أو القناة كوفييه الأكثر شيوعا لدراسة مسببات الأمراض الميكروبية في الزرد ومفيدة لدراسة التفاعلات بين المضيف والخلايا الميكروبية، والاستجابات خلوى، والاختلاف في الفوعة بين سلالات الممرض. لالكائنات الحية الدقيقة المتزايد أبطأ، والحقن في وقت مبكر في الكيس المحي من الجنين في مرحلة 16-1،000 الخلايا يمكن استخدامها لتوليد العدوى النظامية 13،14، مع مرحلة التطوير الأمثل ل microinjection من الكائنات الحية الدقيقة التي تشهد نموا بطيئا جدت لتكون بين المرحلة 16-128 خلية 15. ومع ذلك، صفار حقن SAC العديد من الميكروبات في مراحل لاحقة من التطور المضيف تميل إلى أن تكون قاتلة إلى tكان من المقرر أن تستضيف البيئة الغنية بالمغذيات للميكروب وعدم التسلل الكريات البيض 16-18.

عدوى موضعية عادة النتائج في الهجرة موجهة من الكريات البيض نحو موقع العدوى التي يمكن قياسها كميا بسهولة مع التصوير غير الغازية. هذا النوع من العدوى يمكن أن تسمح للتشريح للآليات التي تتوسط هجرة الكريات البيض وكذلك التحقيق في قدرات المهاجرة وأكلة مختلفة من مختلف السكان الكريات البيض. التهابات موضعية مفيدة أيضا عند دراسة الاختلافات في الفوعة بين السلالات البكتيرية وكذلك دراسة آليات الغزو ميكروب منذ الحواجز المادية المضيف يجب أن عبرت عن عدوى موضعية لتصبح النظامية. وعادة ما تثار الزرد عند درجة حرارة 25-31 ° C 19، ولكنها يمكن أيضا أن الحفاظ على درجات حرارة تصل إلى 34-35 درجة مئوية لمدة دراسات من الغزو من بعض مسببات الأمراض البشرية مع متطلبات درجة حرارة صارمةلالفوعة 20 و 21.

وقد استخدمت العديد من المواقع المختلفة لتوليد عدوى بكتيرية موضعية في البداية بما في البطين الدماغ المؤخر 22، الظهرية العضلات الذيل 18، جوف التامور 23، والحويصلة الأذنية (الأذن) 5، 16، 24. ومع ذلك، فقد وجد أن حقن البكتيريا في عضلة الذيل يمكن أن يسبب تلف الأنسجة والتهاب مستقلة عن البكتيريا، والتي قد تحرف النتائج عند التحقيق استجابة الكريات البيض 13. على الرغم من أن أقل ضرر يرتبط مع الحقن في الدماغ المؤخر وعلى الرغم من أنه يخلو في البداية من الكريات البيض في الأجنة الشباب، البطين الدماغ المؤخر مكاسب بشكل مطرد خلايا مناعية أكثر مع مرور الوقت كما تأخذ الخلايا الدبقية الصغيرة إقامة. البطين الدماغ المؤخر هو أيضا المكان أكثر صعوبة في الصورة. الحويصلة الأذنية هي تجويف جوفاء مغلقة مع أي الوصول المباشر إلى الأوعية الدموية 25 و 26. فمن عادة خالية من ليوkocytes، ولكن الكريات البيض يمكن تجنيدهم للالحويصلة الأذنية في الاستجابة للمثيرات الالتهابية مثل التهاب. وهو أيضا الموقع المفضل من Microinjection من البكتيريا في العمر الزرد 2-3 أيام بعد الإخصاب (إدارة الشرطة الاتحادية) بسبب سهولة التصوير والتصور للحقن. لذلك، اخترنا الحويصلة الأذنية كما موقعنا من عدوى بكتيرية موضعية.

Protocol

واستمرت الكبار والجنينية الزرد وفقا لمركز جامعة ويسكونسن ماديسون الثروة الحيوانية البحوث. 1. إعداد حقن مكروي إبر إعداد الإبر حقن الزجاج الشعرية جدار رقيق (1.0 OD / 0.75 ID) باستخدام جهاز…

Representative Results

Microinjection من S. iniae في الحويصلة الأذنية (الشكل 1) والشكل (2) النتائج في رد المضيف محلية في البداية. عندما تم حقنها بشكل صحيح، يجب أن ينظر إلى البكتيريا فقط في الحويصلة الأذنية وليس في الأنسجة المحيطة أو الدم. هذا يمكن تصور خلال حقن مكروي باستخدام الفينول صبغة ?…

Discussion

طريقة العدوى المستخدم هنا هو مفيد لدراسة الاستجابة المناعية لعدوى موضعية في البداية في 2-3 أجنة DPF واليرقات. محور حافز التهابات، مثل العدوى، في تجويف مغلق مثل الحويصلة الأذنية يسمح لدراسة العدلات والبلاعم الكيميائي والبلعمة. التحذير واحدة من حقن البكتيريا في الحويصل…

開示

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

فإن الكتاب أود أن أشكر أعضاء مختبر للرعاية الزرد والصيانة. وأيد هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة، جائزة الخدمة القومي للبحوث A155397 لEA هارفي وNIH R01GM074827 لآنا Huttenlocher.

Materials

1.7 ml eppendorfs MidSci AVSS1700
14 ml falcon tube BD Falcon 352059
27 G x 1/2 in. needle BD Biosciences 305109
96 well plate Corning Incorporated 3596
Agar BD Biosciences 214030
CellTracker Red Molecular Probes, Invitrogen C34552
CNA agar Dot Scientific, Inc 7126A
Disposable transfer pipets Fisher Scientific 13-711-7m
Dissecting Scope Nikon SMZ745
DMSO Sigma Aldrich D2650
Ethanol 200 proof MDS 2292
Fine tweezers Fine Science Tools 11251-20
Gel comb VWR 27372-482 4.2 mm width, 1.5 mm thick
Glass bottom dishes Custom made by drilling a 16–18 mm hole in the center of a 35-mm tissue culture dish bottom and placing a 22-mm round #1 coverslip in the hole and sealing with a thin layer of Norland Optical Adhesive 68 cured by UV light.
Glycerol Fisher Scientific G33-4
High melt agarose Denville Scientific, Inc. CA3510-6
Hydrogen peroxide Fisher Scientific H325
Laser Scanning Confocal Microscope Olympus with FV-1000 system
Low melt agarose Fisher BP165-25
Magnetic stand Tritech (Narishige) GJ-1
Microinjection system Parker Picospritzer III
Microloader pipet tips Eppendorf 930001007
Micromanipulator Tritech (Narishige) M-152
Micropipette puller Sutter Instrument Company Flaming/Brown P-97
Nanodrop spectrophotmeter Thermo Scientific ND-1000
N-Phenylthiourea (PTU) Sigma aldrich P7629
Paraformaldheyde Electron Microscopy Sciences 15710
Petri Dishes Fisher Scientific FB0875712 100 mm x 15 mm
Phenol Sigma Aldrich P-4557
Phenol Red Ricca Chemoical Company 572516
Phosphate Buffered Saline Fisher Scientific BP665-1
Potassium hydroxide Sigma Aldrich P-6310
Pronase Roche 165921
Protease peptone Fluka Biochemika 29185
Small cell culture dish Corning Incorporated 430165 35 mm x 10 mm
Sudan Black Sigma Aldrich S2380
Thin wall glass capillary injection needles World Precision Instruments, Inc. TW100-3
Todd Hewitt Sigma Aldrich/Fluka Analytical T1438
Tricaine (ethyl 3-aminobenzoate) Argent Chemical Laboratory/Finquel C-FINQ-UE-100G
Triton X-100 Fisher Scientific BP151-500
Tween 20 Fisher Scientific BP337-500
Yeast extract Fluka Biochemika 92144

参考文献

  1. Agnew, W., Barnes, A. C. Streptococcus iniae: An aquatic pathogen of global veterinary significance and a challenging candidate for reliable vaccination. Vet. Microbiol. 122 (1-2), 1-15 (2007).
  2. Danilova, N., Steiner, L. A. B cells develop in the zebrafish pancreas. Proc. Natl. Acad. Sci. 99, 13711-13716 (2002).
  3. Lam, S. H., Chua, H. L., Gong, Z., Lam, T. J., Sin, Y. M. Development and maturation of the immune system in zebrafish, Danio rerio: a gene expression profiling, in situ hybridization and immunological study. Dev. Comp. Immunol. 28 (1), 9-28 (2004).
  4. Willett, C. E., Cortes, A., Zuasti, A., Zapata, A. Early Hematopoiesis and Developing Lymphoid Organs in the Zebrafish. Dev. Dyn. 214, 323-336 (1999).
  5. Le Guyader, D., et al. Origins and unconventional behavior of neutrophils in developing zebrafish. Blood. 111 (1), 132-141 (2008).
  6. Herbomel, P., Thisse, B., Thisse, C. Ontogeny and behaviour of early macrophages in the zebrafish embryo. Development(Cambridge, England). 126 (17), 3735-3745 (1999).
  7. Neely, M. N., Pfeifer, J. D., Caparon, M. G. Streptococcus-Zebrafish Model of Bacterial Pathogenesis. Infect. Immun. 70 (7), 3904-3914 (2002).
  8. Jault, C., Pichon, L., Chluba, J. Toll-like receptor gene family and TIR-domain adapters in Danio rerio. Mol. Immunol. 40 (11), 759-771 (2004).
  9. Meijer, A. H., et al. Expression analysis of the Toll-like receptor and TIR domain adaptor families of zebrafish. Mol. immunol. 40 (11), 773-783 (2004).
  10. Seeger, A., Mayer, W. E., Klein, J. A Complement Factor B-Like cDNA clone from the Zebrafish (Brachydanio rerio). Mol. immunol. 33, 511-520 (1996).
  11. Hermann, A. C., Millard, P. J., Blake, S. L., Kim, C. H. Development of a respiratory burst assay using zebrafish kidneys and embryos. J. Immunol. Methods. 292 (1-2), 119-129 (2004).
  12. Yoo, S. K., Huttenlocher, A. Spatiotemporal photolabeling of neutrophil trafficking during inflammation in live zebrafish. J. Leukoc. Biol. 89 (5), 661-667 (2011).
  13. Benard, E. L., et al. Infection of Zebrafish Embryos with Intracellular Bacterial Pathogens. J. Vis. Exp. , 1-9 (2012).
  14. Carvalho, R., et al. A High-Throughput Screen for Tuberculosis Progression. PLoS ONE. 6 (2), e16779 (2011).
  15. Veneman, W. J., Marín-Juez, R., et al. Establishment and Optimization of a High Throughput Setup to Study Staphylococcus epidermidis and Mycobacterium marinum Infection as a Model for Drug Discovery. J. Vis. Exp. (88), (2014).
  16. Deng, Q., Harvie, E. A., Huttenlocher, A. Distinct signaling mechanisms mediate neutrophil attraction to bacterial infection and tissue injury. Cell. Microbiol. , (2012).
  17. Sar, A. M., et al. Zebrafish embryos as a model host for the real time analysis of Salmonella typhimurium infections. Cell. Microbiol. 5 (9), 601-611 (2003).
  18. Lin, A., Loughman, J. A., Zinselmeyer, B. H., Miller, M. J., Caparon, M. G. Streptolysin S Inhibits Neutrophil Recruitment during the Early Stages of Streptococcus pyogenes Infection. Infect. Immun. 77 (11), 5190-5201 (2009).
  19. Volhard, C., Dahm, R. . Zebrafish: A Practical Approach. , (2002).
  20. He, S., et al. Neutrophil-mediated experimental metastasis is enhanced by VEGFR inhibition in a zebrafish xenograft model. J. Pathol. 227 (4), 431-445 (2012).
  21. Haldi, M., Ton, C., Seng, W. L., McGrath, P. Human melanoma cells transplanted into zebrafish proliferate, migrate, produce melanin, form masses and stimulate angiogenesis in zebrafish. Angiogenesis. 9 (9), 139-151 (2006).
  22. Davis, J. M., et al. Real-time visualization of mycobacterium-macrophage interactions leading to initiation of granuloma formation in zebrafish embryos. Immunity. 17 (6), 693-702 (2002).
  23. Wiles, T. J., Bower, J. M., Redd, M. J., Mulvey, M. A. Use of Zebrafish to Probe the Divergent Virulence Potentials and Toxin Requirements of Extraintestinal Pathogenic Escherichia coli. PLoS Pathog. 5 (12), e1000697 (2009).
  24. Harvie, E. A., Green, J. M., Neely, M. N., Huttenlocher, A. Innate Immune Response to Streptococcus iniae Infection in Zebrafish Larvae. Infect. Immun. 81 (1), 110-121 (2013).
  25. Haddon, C., Lewis, J. Early Ear Development in the Embryo of the Zebrafish, Danio rerio. J. Comp. Neurol. 365, 113-128 (1996).
  26. Whitfield, T. T., Riley, B. B., Chiang, M. -. Y., Phillips, B. Development of the zebrafish inner ear. Dev. Dyn. 223 (4), 427-458 (2002).
  27. Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function. J. Vis. Exp. (25), (2009).
  28. Colucci-Guyon, E., Tinevez, J. Y., Renshaw, S. A., Herbomel, P. Strategies of professional phagocytes in vivo: unlike macrophages, neutrophils engulf only surface-associated microbes. J. Cell Sci. 124 (18), 3053-3059 (2011).
  29. Gurskaya, N. G., et al. Engineering of a monomeric green-to-red photoactivatable fluorescent protein induced by blue light. Nat. Biotechnol. 24 (4), 461-465 (2006).
  30. Deng, Q., et al. Localized bacterial infection induces systemic activation of neutrophils through Cxcr2 signaling in zebrafish. J. Leukoc. Biol. 93 (5), 761-769 (2013).

Play Video

記事を引用
Harvie, E. A., Huttenlocher, A. Non-invasive Imaging of the Innate Immune Response in a Zebrafish Larval Model of Streptococcus iniae Infection. J. Vis. Exp. (98), e52788, doi:10.3791/52788 (2015).

View Video