概要

Injection virale intracérébro du cerveau de souris nouveau-né pour la transduction neuronale persistante et généralisée

Published: September 15, 2014
doi:

概要

Here we demonstrate a technique for widespread neuronal transduction by intraventricular injection of adeno-associated virus into the neonatal mouse brain. This method provides a rapid and easy way to attain lifelong expression of virally-delivered transgenes.

Abstract

Avec le rythme des progrès scientifiques accélérer rapidement, de nouvelles méthodes sont nécessaires pour neurosciences expérimentales de manipuler rapidement et facilement l'expression des gènes dans le cerveau de la souris. Nous décrivons ici une technique introduite par Passini et Wolfe pour la livraison intracrânienne directe des transgènes d'origine virale codée dans le cerveau de souris nouveau-né. Dans sa forme la plus simple, la procédure exige seulement un seau à glace et une seringue microlitre. Toutefois, le protocole peut également être adapté pour une utilisation avec des cadres stéréotaxiques d'améliorer la cohérence de nouveaux chercheurs de la technique. Le procédé repose sur la capacité des virus adéno-associé (AAV) de se déplacer librement dans les ventricules cérébraux dans le parenchyme du cerveau tandis que le revêtement épendymaire est encore immature au cours de la première de 12 à 24 heures après la naissance. Injection intraventriculaire de l'AAV à cet âge, les résultats dans la transduction généralisée des neurones dans le cerveau. Expression commence dans les jours suivant l'injection et persiste pendant la lifetime de l'animal. Titre viral peut être réglé pour contrôler la densité de neurones transduites, tandis que la co-expression d'une protéine fluorescente fournit une étiquette vital de cellules transduites. Avec la disponibilité croissante des installations de base virales pour fournir des réactifs à la fois hors-the-shelf, pré-emballés et préparation virale coutume, cette approche offre une méthode opportune pour la manipulation de l'expression des gènes dans le cerveau de la souris qui est rapide, facile et beaucoup moins coûteux d'ingénierie traditionnel de la lignée germinale.

Introduction

Les méthodes traditionnelles pour modifier l'expression des gènes de neurones ont besoin de temps et les manipulations de la lignée germinale coûteux. Alternative de novo approches comme dans l'électroporation in utero ou injection stéréotaxique lentiviral donner des résultats plus rapides et moins coûteuses mais présentent l'inconvénient de nécessiter une intervention chirurgicale complexe 1-3. En outre, l'expression du transgène a une portée spatiale limitée avec ces méthodes. Ici, nous décrivons une méthode rapide, simple et économique pour la manipulation neuronale généralisée par injection intraventriculaire de virus adéno-associé (AAV) dans le cerveau de souris nouveau-nés. La méthode a été décrite par John Wolfe et Marco Passini en 2001, où ils ont suggéré petite taille de particule d'AAV a permis de se diffuser dans le liquide céphalo-rachidien qui passe à partir des ventricules latéraux à travers la barrière épendymaire immatures et dans le parenchyme cérébral 4, 5. L'injection intraventriculaire de l'AAV à l'intérieur de la fIRST 24 h après la naissance des rendements de transduction virale généralisée des sous-ensembles de neurones couvrant toutes les régions du cerveau, des bulbes olfactifs de tronc cérébral 6,7. Transgènes d'origine virale livrés sont exprimés et active dans les jours suivant l'injection et persistent jusqu'à un an après la transduction. Ainsi, cette manipulation polyvalent permet des études allant du développement du cerveau postnatal précoce de vieillissement et la dégénérescence chez l'adulte.

En adaptant la technique à nos besoins expérimentaux spécifiques, nous avons mis l'accent principalement sur ​​AAV8 sérotype car elle est la plus efficace pour transduire des neurones 6. Nous montrons que le titre viral peut être dilué pour contrôler la densité de neurones transduites pour essai de conséquences expériences cellulaires intrinsèques de manipulation génétique. De plus, nous démontrons que les deux virus peuvent être co-injectés pour produire des profils d'expression qui sont sollicités vers des ensembles distincts de neurones ou qui se chevauchent, en fonction des sérotypes choisis pourencapsidation virale. Notre travail se développe la polyvalence de cette technique pour une utilisation dans un large éventail de paramètres de neurosciences expérimentales.

Protocol

Effectuer toutes les procédures et protocoles impliquant des animaux conformément aux National Institutes of Health Guide pour le soin et l'utilisation des animaux de laboratoire. Les procédures décrites ici ont été examinés et approuvés par le Baylor College of Medicine institutionnel de protection des animaux et l'utilisation Comité. virus adéno-associé (AAV) vecteurs de réplication incompétent pour la livraison du transgène dans le cerveau de rongeurs sont approuvés…

Representative Results

Le succès d'injection intraventriculaire rendement viral d'expression généralisée et robuste neuronale. Ici, nous avons évalué la transduction virale utilisant YFP ou tdTomato gènes fluorescents sous le contrôle du promoteur de la bêta de poulet de l'actine (promoteur de l'ABC). Ces constructions ont été emballés dans AAV8 et injecté dans les ventricules latéraux de souris (P0) ICR néonatales. Titres viraux élevés (10 à 10 particules par hémisphère) ont donné lieu à l&#39…

Discussion

Nous avons décrit un procédé polyvalent pour la manipulation de l'expression génique en utilisant des neurones AAV comme vecteur de livraison répandu dans le cerveau de souris nouveau-nés. Comparé à d'autres méthodes de transgénèse neuronale tels que électroporation in utero ou une injection intracrânienne stéréotaxique 2,3, injection virale néonatale est relativement facile et simple. La procédure de base peut être réalisé en quelques minutes seulement avec un seau à g…

開示

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

This research was supported by the Robert A. and Rene E. Belfer Family Foundation, NIA R21 AG038856 (JLJ), BrightFocus Foundation Alzheimer’s Disease research grant A2010097 (JLJ), and NIA Biology of Aging Training grant T32 AG000183 (support for SDG).

Materials

Name of Material/ Equipment Company Catalog Number Comments/Description
ICR outbred mice Harlan Hsd:ICR (CD-1) This strain is also known as CD-1
FVB inbred mice The Jackson Laboratory 1800 5-6 weeks of age
Nestlets Lab Supply NESTLETS
Shepherd shacks Lab Supply SS-mouse
High fat rodent chow Purina Mills PicoLab Mouse diet 20, #5058 This is our standard breeder chow
High fat rodent chow (alternative) Harlan Laboratories Teklad Global 19% protein rodent diet #2019S If low phytoestrogen, autoclavable diet is needed
Injection syringe Hamilton 7653-01 10 ml syringe
Injection needles Hamilton 7803-04, RN 6PK PT4 32 gauge, for standard P0 injections
Metal plate for cryoanesthesia McMaster Carr 8975K439 Raw aluminum plate, 6” x 12”, 0.25” thick, will need to be cut into 3 equal pieces and edges sanded by local machine shop
Small animal stereotaxic device with digital readout David Kopf Instruments Model 940
Universal syringe holder with needle support foot David Kopf Instruments Model 1772-F1
Neonatal frame Stoelting 51625 Officially called a mouse and neonatal rat adaptor
Biohazard disposal bags with sterile indicator VWR 14220-030 Important! – Check with local veterinary and environmental safety staff to learn your institute’s protocol for biohazard waste disposal

参考文献

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  3. Puntel, M., et al. Gene transfer into rat brain using adenoviral vectors. Curr Protoc Neurosci. 4, (2010).
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  5. Passini, M. A., et al. Intraventricular brain injection of adeno-associated virus type 1 (AAV1) in neonatal mice results in complementary patterns of neuronal transduction to AAV2 and total long-term correction of storage lesions in the brains of beta-glucuronidase-deficient mice. J Virol. 77, 7034-7040 (2003).
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記事を引用
Kim, J., Grunke, S. D., Levites, Y., Golde, T. E., Jankowsky, J. L. Intracerebroventricular Viral Injection of the Neonatal Mouse Brain for Persistent and Widespread Neuronal Transduction. J. Vis. Exp. (91), e51863, doi:10.3791/51863 (2014).

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