Intracerebroventricular Viral Injektion der Neonatal Maus Gehirn für anhaltenden und verbreiteten Neuronale Transduction
概要
Here we demonstrate a technique for widespread neuronal transduction by intraventricular injection of adeno-associated virus into the neonatal mouse brain. This method provides a rapid and easy way to attain lifelong expression of virally-delivered transgenes.
Abstract
Mit dem Tempo der wissenschaftlichen Fortschritt zu beschleunigen schnell, werden neue Methoden zur experimentellen Neurowissenschaften benötigt, um die Genexpression im Gehirn von Mäusen schnell und einfach zu manipulieren. Hier beschreiben wir eine Technik zuerst von Passini und Wolfe für die direkte Lieferung von intrakraniellen viral-kodierte Transgenen in der Neugeborenen-Gehirn der Maus eingeführt. In seiner einfachsten Form benötigt das Verfahren nur einen Eiskübel und ein Mikroliter-Spritze. Jedoch kann das Protokoll auch für die Verwendung mit der stereotaktischen Rahmen angepasst ist, um Konsistenz für Forscher neu in der Technik zu verbessern. Das Verfahren beruht auf der Fähigkeit des Adeno-assoziierten Virus (AAV), frei von den Hirnkammern bewegen in das Hirnparenchym, während die ependymale Futter ist immer noch in der ersten 12-24 h nach der Geburt unreif. Intraventrikuläre Injektion von AAV in diesem Alter weit verbreitet Ergebnisse Übertragung von Nervenzellen im Gehirn. Ausdruck beginnt innerhalb weniger Tage der Injektion und hält für die lifetime des Tieres. Virustiter eingestellt werden, um die Dichte der transduzierten Neuronen steuern, während die Co-Expression eines fluoreszierenden Proteins ist eine notwendige Beschriftung der transduzierten Zellen werden. Mit der steigenden Verfügbarkeit von viralen Kernanlagen, sowohl off-the-shelf, abgepackte Reagenzien und individuelle Viruspräparat zu schaffen, bietet dieser Ansatz eine zeitnahe Verfahren zur Manipulation der Genexpression im Gehirn der Maus, die schnell, einfach und weit weniger teuer ist als traditionelle Keimbahntherapie.
Introduction
Traditionelle Methoden zur Modifizierung von neuronalen Genexpression erfordern zeitaufwendig und teuer Keimbahnmanipulationen. Alternative de novo-Ansätze wie in utero Elektroporation oder stereotaktische Injektion lentiviralen ergeben schnellere Ergebnisse und sind weniger teuer, haben aber den Nachteil, dass komplexe chirurgische Intervention 1-3. Darüber hinaus hat die Transgen-Expression einen begrenzten räumlichen Bereich mit diesen Methoden. Hier beschreiben wir eine schnelle, einfache und kostengünstige Methode für die weit verbreiteten neuronalen Manipulation über intraventrikuläre Injektion von Adeno-assoziierte Viren (AAV) in der Neugeborenen-Gehirn der Maus. Das Verfahren wurde von John Wolfe und Marco Passini 2001, wo sie vorgeschlagen kleinen Teilchengröße von AAV gestattet es, innerhalb des Rückenmarksflüssigkeit diffundieren, wie es geht aus den lateralen Ventrikel durch die unreifen Ependymzellen Schranke und in das Hirnparenchym 4, 5. Intraventrikuläre Injektion von AAV in der fIRST 24 Stunden nach der Geburt Ausbeuten verbreiteten viralen Transduktion von neuronalen Teilmengen spannt jede Region des Gehirns, von den Riechkolben des Hirnstamms 6,7. Viral geliefert Transgene exprimiert und innerhalb weniger Tage nach Injektion aktiv und bleiben bis zu einem Jahr nach Transduktion. Somit ermöglicht dieses vielseitige Manipulation von Studien der frühen postnatalen Entwicklung des Gehirns von Alterung und Degeneration in der Erwachsenen.
Bei der Anpassung der Technik für unsere spezielle experimentelle Bedürfnisse wir uns hauptsächlich auf AAV8 Serotyp konzentriert, weil es am effizientesten Wandler Neuronen 6. Wir zeigen, dass virale Titer verdünnt, um die Dichte der transduzierten Neuronen für Experimente Testzellengrenz Folgen genetische Manipulation zu steuern. Darüber hinaus zeigen wir, dass die beiden Viren konnte gemeinsam injiziert, um die Expressionsmuster, die in Richtung unterschiedliche oder überlappende Gruppen von Neuronen vorgespannt sind, zu erzeugen, in Abhängigkeit von den für die gewählte Serotypenvirale Verpackungs. Unsere Arbeit erweitert die Vielseitigkeit dieser Technik zum Einsatz in einem breiten Spektrum von experimentellen Neurowissenschaften-Einstellungen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Wir haben ein vielseitiges Verfahren zum Manipulieren von neuronalen Genexpression unter Verwendung von AAV als Vehikel für die Abgabe in den weit verbreiteten neonatalen Maushirn beschrieben. Im Vergleich zu anderen Methoden der neuronalen Transgenese wie in utero Elektroporation 1 oder stereo intrakranielle Injektion 2,3 ist neonatalen viralen Injektion relativ einfach und unkompliziert. Die grundsätzliche Vorgehensweise ist in wenigen Minuten mit nur einem Eiskübel und ein Mikroliter-Spritze …
開示
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This research was supported by the Robert A. and Rene E. Belfer Family Foundation, NIA R21 AG038856 (JLJ), BrightFocus Foundation Alzheimer’s Disease research grant A2010097 (JLJ), and NIA Biology of Aging Training grant T32 AG000183 (support for SDG).
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| ICR outbred mice | Harlan | Hsd:ICR (CD-1) | This strain is also known as CD-1 |
| FVB inbred mice | The Jackson Laboratory | 1800 | 5-6 weeks of age |
| Nestlets | Lab Supply | NESTLETS | |
| Shepherd shacks | Lab Supply | SS-mouse | |
| High fat rodent chow | Purina Mills | PicoLab Mouse diet 20, #5058 | This is our standard breeder chow |
| High fat rodent chow (alternative) | Harlan Laboratories | Teklad Global 19% protein rodent diet #2019S | If low phytoestrogen, autoclavable diet is needed |
| Injection syringe | Hamilton | 7653-01 | 10 ml syringe |
| Injection needles | Hamilton | 7803-04, RN 6PK PT4 | 32 gauge, for standard P0 injections |
| Metal plate for cryoanesthesia | McMaster Carr | 8975K439 | Raw aluminum plate, 6” x 12”, 0.25” thick, will need to be cut into 3 equal pieces and edges sanded by local machine shop |
| Small animal stereotaxic device with digital readout | David Kopf Instruments | Model 940 | |
| Universal syringe holder with needle support foot | David Kopf Instruments | Model 1772-F1 | |
| Neonatal frame | Stoelting | 51625 | Officially called a mouse and neonatal rat adaptor |
| Biohazard disposal bags with sterile indicator | VWR | 14220-030 | Important! – Check with local veterinary and environmental safety staff to learn your institute’s protocol for biohazard waste disposal |
参考文献
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