حقن الفيروسي Intracerebroventricular من حديثي الولادة ماوس الدماغ للاستمرار وانتشار تنبيغ العصبية
概要
Here we demonstrate a technique for widespread neuronal transduction by intraventricular injection of adeno-associated virus into the neonatal mouse brain. This method provides a rapid and easy way to attain lifelong expression of virally-delivered transgenes.
Abstract
مع وتيرة التقدم العلمي المتسارع، وهناك حاجة إلى أساليب جديدة لعلم الأعصاب التجريبي بسرعة وسهولة التلاعب التعبير الجيني في مخ الفأر. نحن هنا وصف تقنية لأول مرة من قبل Passini وولف للتسليم داخل الجمجمة المباشر من الجينات المحورة فيروسي-المشفرة في مخ الفأر حديثي الولادة. في أبسط أشكاله، فإن الإجراء يتطلب سوى دلو الجليد وحقنة ميكروليتر. ومع ذلك، يمكن أيضا أن تتكيف بروتوكول للاستخدام مع إطارات التجسيمي لتحسين الاتساق للباحثين جديد لهذه التقنية. تعتمد هذه الطريقة على قدرة الغدة المرتبطة الفيروسات (AAV) للتحرك بحرية من البطينات الدماغية في لحمة الدماغ في حين بطانة البطانة العصبية لا تزال غير ناضجة خلال 12-24 ساعة الأولى بعد الولادة. الحقن داخل البطينات من AAV في هذه النتائج في سن التنبيغ على نطاق واسع من الخلايا العصبية في جميع أنحاء الدماغ. يبدأ التعبير في غضون أيام من الحقن ويستمر لlifetim(ه) من الحيوان. عيار الفيروسية يمكن تعديلها للتحكم في كثافة الخلايا العصبية transduced، في حين شارك في التعبير عن بروتين فلوري يوفر تسمية الحيوية للخلايا transduced. مع ارتفاع توافر المرافق الأساسية الفيروسية لتوفير الكواشف كلا قبالة الجاهزة للاستخدام، وتعبئتها مسبقا وإعداد الفيروسي العرف، وهذا النهج يوفر طريقة في الوقت المناسب لمعالجة التعبير الجيني في مخ الفأر التي هي سريعة وسهلة وأقل تكلفة بكثير من الهندسة التقليدية سلالة الجرثومية.
Introduction
الطرق التقليدية لتعديل العصبي التعبير الجيني تتطلب وقتا طويلا والتلاعب سلالة الجرثومية باهظة الثمن. البديل دي نوفو يقترب مثل Electroporation للفي الرحم أو الحقن lentiviral التجسيمي تحقق نتائج أسرع وأقل تكلفة ولكن لديها عيب تتطلب التدخل الجراحي المعقد 1-3. وعلاوة على ذلك، التعبير التحوير لديها مجموعة والمكاني المحدود مع هذه الأساليب. هنا، نحن تصف طريقة سريعة وسهلة واقتصادية للتلاعب على نطاق واسع عن طريق حقن الخلايا العصبية داخل البطينات من الغدة المرتبطة الفيروسات (AAV) في مخ الفأر حديثي الولادة. وقد وصفت طريقة أول مرة من قبل جون وولف وماركو Passini في عام 2001، حيث اقترح حجم الجسيمات الصغيرة من سمح AAV لنزع فتيل داخل السائل الدماغي الشوكي لأنها تمر من البطينات الجانبية من خلال حاجز بطانية عصبية غير ناضجة وإلى لحمة الدماغ 4، 5. الحقن داخل البطينات من AAV داخل وIRST 24 ساعة بعد الولادة عوائد تنبيغ الفيروسية على نطاق واسع من مجموعات فرعية العصبية التي تغطي كل منطقة من مناطق الدماغ، من بصيلات الشم لجذع الدماغ 6،7. يتم التعبير عن الجينات المحورة تسليمها فيروسي ونشطة خلال أيام من الحقن ويستمر لمدة تصل الى عام بعد ترنسدوكأيشن. وبالتالي، هذا التلاعب تنوعا يتيح الدراسات تتراوح بين أوائل نمو الدماغ بعد الولادة إلى الشيخوخة وانحطاط في الكبار.
في تطويع التقنية لاحتياجات تجريبية محددة لدينا، فقد ركزنا بشكل أساسي على AAV8 المصلي لأنه هو الأكثر كفاءة في transducing الخلايا العصبية 6. وتبين لنا أن عيار الفيروسية يمكن أن تضعف السيطرة على كثافة الخلايا العصبية transduced للتجارب اختبار خلايا الجوهرية عواقب التلاعب الجيني. بالإضافة إلى ذلك، علينا أن نظهر أن اثنين من الفيروسات يمكن أن يشترك حقن لإنتاج أنماط التعبير التي هي منحازة مجموعات متميزة أو متداخلة من الخلايا العصبية، اعتمادا على الأنماط المصلية المختارة لالتعبئة والتغليف الفيروسي. عملنا توسع براعة هذه التقنية للاستخدام في مجموعة واسعة من إعدادات علم الأعصاب التجريبية.
Protocol
Representative Results
Discussion
وصفناها إجراء تنوعا لمعالجة الخلايا العصبية التعبير الجيني باستخدام AAV كوسيلة للتسليم على نطاق واسع في مخ الفأر حديثي الولادة. بالمقارنة مع غيرها من أساليب نقل الجينات العصبية مثل في الرحم Electroporation لل1 أو التجسيمي الحقن داخل الجمجمة 2،3، حقن الفيروسي حديث…
開示
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This research was supported by the Robert A. and Rene E. Belfer Family Foundation, NIA R21 AG038856 (JLJ), BrightFocus Foundation Alzheimer’s Disease research grant A2010097 (JLJ), and NIA Biology of Aging Training grant T32 AG000183 (support for SDG).
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| ICR outbred mice | Harlan | Hsd:ICR (CD-1) | This strain is also known as CD-1 |
| FVB inbred mice | The Jackson Laboratory | 1800 | 5-6 weeks of age |
| Nestlets | Lab Supply | NESTLETS | |
| Shepherd shacks | Lab Supply | SS-mouse | |
| High fat rodent chow | Purina Mills | PicoLab Mouse diet 20, #5058 | This is our standard breeder chow |
| High fat rodent chow (alternative) | Harlan Laboratories | Teklad Global 19% protein rodent diet #2019S | If low phytoestrogen, autoclavable diet is needed |
| Injection syringe | Hamilton | 7653-01 | 10 ml syringe |
| Injection needles | Hamilton | 7803-04, RN 6PK PT4 | 32 gauge, for standard P0 injections |
| Metal plate for cryoanesthesia | McMaster Carr | 8975K439 | Raw aluminum plate, 6” x 12”, 0.25” thick, will need to be cut into 3 equal pieces and edges sanded by local machine shop |
| Small animal stereotaxic device with digital readout | David Kopf Instruments | Model 940 | |
| Universal syringe holder with needle support foot | David Kopf Instruments | Model 1772-F1 | |
| Neonatal frame | Stoelting | 51625 | Officially called a mouse and neonatal rat adaptor |
| Biohazard disposal bags with sterile indicator | VWR | 14220-030 | Important! – Check with local veterinary and environmental safety staff to learn your institute’s protocol for biohazard waste disposal |
参考文献
- De Vry, J., et al. In vivo electroporation of the central nervous system: a non-viral approach for targeted gene delivery. Progress in neurobiology. 92, 227-244 (2010).
- Sun, B., Gan, L. Manipulation of gene expression in the central nervous system with lentiviral vectors. Methods Mol Biol. 670, 155-168 (2011).
- Puntel, M., et al. Gene transfer into rat brain using adenoviral vectors. Curr Protoc Neurosci. 4, (2010).
- Passini, M. A., Wolfe, J. H. Widespread gene delivery and structure-specific patterns of expression in the brain after intraventricular injections of neonatal mice with an adeno-associated virus vector. J Virol. 75, 12382-12392 (2001).
- Passini, M. A., et al. Intraventricular brain injection of adeno-associated virus type 1 (AAV1) in neonatal mice results in complementary patterns of neuronal transduction to AAV2 and total long-term correction of storage lesions in the brains of beta-glucuronidase-deficient mice. J Virol. 77, 7034-7040 (2003).
- Kim, J. Y., et al. Viral transduction of the neonatal brain delivers controllable genetic mosaicism for visualising and manipulating neuronal circuits in vivo. Eur J Neurosci. 37, 1203-1220 (2013).
- Chakrabarty, P., et al. Capsid serotype and timing of injection determines AAV transduction in the neonatal mice brain. PloS one. 8, (2013).
- Croyle, M. A., Cheng, X., Wilson, J. M. Development of formulations that enhance physical stability of viral vectors for gene therapy. Gene therapy. 8, 1281-1290 (2001).
- Bauer, H. C., Bauer, H. Neural induction of the blood-brain barrier: still an enigma. 細胞および分子神経生物学. 20, 13-28 (2000).
- Cearley, C. N., et al. Expanded repertoire of AAV vector serotypes mediate unique patterns of transduction in mouse brain. Molecular therapy : the journal of the American Society of Gene Therapy. 16, 1710-1718 (2008).
- Grimm, D., et al. In vitro and in vivo gene therapy vector evolution via multispecies interbreeding and retargeting of adeno-associated viruses. J Virol. 82, 5887-5911 (2008).
