Общие замечания: Все операции должны проводиться в вертикальном рассекает микроскоп (Olympus, SZX10 с Z-Axis Crank Сообщение с STU2 StandBoom Stand) и с помощью хирургического коагулятора. Вентиляция имеет решающее значение для процедуры, и поэтому определенное количество времени нужно потратить на выбор вентилятора и оптимизации вентиляции техники. Температура, давление и анестезия должна быть стабильной во всем. 1. Анестезия, интубации и мониторинг Используйте C57BL / 6 мышей, которые, по крайней мере 10 недель. Вызвать анестезии с использованием натрия фенобарбитала в дозе 70 мг / кг массы тела Поддержание анестезии с приблизительно 10 мг / кг / ч натрия фенобарбитала. Будьте осторожны с передозировкой, так как это может привести к значительному снижению кровяного давления. Re-дозирование фенобарбитала – даже после часов, может привести к серьезному увеличению плазменных уровней. На основании убедительных доказательств в отношении изофлуран как кардиопротекторное соединения мы рекомендуем использовать "инертной" и хорошо организованной пентобарбитал в модели ишемии миокарда 46-56. Место на мышах с контролируемой температурой подогревом таблицы (РТ, Effenberg, Мюнхен, Германия) с ректальный зонд термометра придается тепловой контроллер обратной связи для поддержания температуры тела при температуре 37 ° C. После анестезии индукции безопасный мышей в положении лежа, с верхних и нижних конечностей придается таблице с помощью ленты и шовный крепятся к лодыжкам. Сделайте то же самое для головы с помощью зубов. Достаточным сдерживающим важно для успешной интубации и хорошо контролируемых операций. Перед операцией, накрыть мышь с минеральным маслом, чтобы уменьшить риск аллергии мыши волос. Expose трахеи хирургическим путем и выполняют интубации трахеи использованием bluntpolyethylene канюль (Insyte 22g, Бектон Дикинсон, США). Вам придется тупой иглой, чтобы иметь возможность использовать его как стилет. Вытяните язык, с помощью пары щипцов, а затем нажать аккуратно в 15-градусный угол по отношению к телу. Даже после воздействия на трахею и с помощью микроскопа, это может потребовать некоторого обучения. Имейте в виду, что небольшое повреждение трахеи может привести к невозможности вентилировать животных по всему шву. Таким образом, если вы сталкиваетесь с проблемами дыхательных путей проверить трахеи для малых отверстий. Подтверждение правильности размещения трубы прямой визуализации канюли в трахее ранее подвергшимися над килем. Подключите трубку к искусственной вентиляции легких. Мы рекомендуем давления контролируемой технике вентиляции с помощью сервопривода 900 С от Siemens (DRE ветеринарный, США). Животные будут затем вентилируемые использованием пик вдоха давлением 10 мбар, частоте 110 вдохов / мин и положительные давления в конце выдоха в 3-5 мбар с FiO 2 = 0,4. Настройки могут потребоваться некоторые корректировки, которые могут быть достигнуты наиболее простым способом проверки легких при открытой хирургии грудной клетки. Убедитесь, что легкие не разрушены или чрезмерно. Несмотря на то, что Servo 900 C построен как вентилятор для человека, его использование в контролируемых условиях давления вентилятор работает отлично для вентиляции мышей. Выполнить анализ газов крови для подтверждения нормального обмена газа (парциальное давление кислорода, PaO 2 из 115 ± 15 мм рт.ст. и парциальное давление углекислого газа, Пако 2 из 38 ± 6 мм рт.ст.) после 4 до 6 часов в режиме вентиляции времени с использованием я-СТАТ Система (Abbott, США). Монитор сердечного ритма и ЭКГ (например, Hewlett Packard, Böblingen, Германия). Убедитесь, что частота сердечных сокращений не опускается ниже 450. Если мышь развивается брадикардия проверки температуры и дозы анестезии / концентрации. Xylacin / кетамин анестезии побуждает сердце сердце 250 / мин, и поэтому не рекомендуется. Применение надлежащего замены жидкости. Инфузии с физиологическим раствором 0,1 мл / час через артериального или венозного катетера должны проводиться до начала ишемии. Кроме того, солевой болюс 500 мкл может быть предоставлена ф до операции. Thoractomy может вызвать падение артериального давления и может потребовать дополнительных солевой боли. После ишемии, скорость инфузии до 1 мл / час может быть необходимо для поддержания среднего артериального давления выше 60 мм рт.ст. и гарантировать достаточную реперфузии миокарда решающее значение для окрашивания использования ТТС. Место сонной артерии (PE10, Совет OD (мм / "), конические> 0,024 mm/.011") для непрерывной регистрации артериального давления. Сонной артерии будут выставлены с помощью тупого рассечения паратрахеальных мышц. После дальнейшего воздействия и тщательно избегать любых тканей травма (особенно из блуждающего нерва), катетер вводится в сосуд с помощью двух швов и небольшой зажим. Приложите руку к телу, прежде чем начать рассекает артерии. Это позволит выставить больше кусок артерии. Узел самого конца проксимальной части сонной артерии. Приложить больше зажима до конца шва, чтобыполучить напряженности. Место другого шва вокруг артерии и артерии рассекают до самого дистального конца. Здесь, место небольшой зажим. Использование микро-ножницы, чтобы вырезать небольшую диагональ открытия в артерию. Держите открытия с прекрасно щипцы (Дюмон, WPI) и заранее надлежащего размера катетер с руки / щипцами. Сделайте узел с вашего второго шва и безопасной артерии. Ослабьте хомут и продвигать катетер дальше. Безопасные катетер с несколькими узлами и лентой. 2. Техника коронарной артерии Окклюзия Рассекают кожу и выставить левую стену грудной клетки при помощи тупого техника рассечения. Сокращение мышцы грудные майоров и несовершеннолетних, чтобы разоблачить грудной клетки стена с прижиганием. Потянув за большой грудной мышцы, легких капель, тем самым, щипцы от электрохирургического устройство может быть вставлены, а, 1-3 мм над легких, горизонтальная линия пересечения разрывы должны быть коагулирует. С помощью ножниц притупляются, разрезать грудную клетку стены. Измененный булавки, где улов пластины удаляется, а тупым концом согнута, которые затем используются, чтобы держать грудную клетку открытой. Чтобы облегчить окончательное размещение шва, коагулируют и сокращение грудной клетки стены вдоль диафрагмы по отношению к нижней левой части грудной клетки. Expose сердце анализируя перикарда. Чтобы избежать диафрагмальное движений удалить и нарезать диафрагмального нерва. Используйте маленькую мокрую палку хлопка с пинцетом и превратить сердце на правой стороне. Определить левой коронарной артерии (ДМС) и убедитесь, что легкие не слишком завышены. Оптимизация открытия грудной клетки, чтобы иметь надежную фиксацию сердца при размещении шва. Если артериальное давление слишком низкое идентификации может быть сложной. Дополнительная Боли физиологического раствора может улучшить определение ДМС. ДМС является ярко-красный судна пересечения сердце горизонтально (в отличие от возвращения вен). Иногда, ДМС видна лучше без микроскопа. Не используйте слишком много света. Это может привести к разорвать отражения решений визуализации невозможно. После ДМС визуально определить, место 8,0 нейлона шва (Prolene, Ethicon, Notiefies, США) около ДМС. Для прерывистого ДМС окклюзии, мы приняли хронический модель кардиомиопатии 42 с использованием подвесной системы весов. Тема шва через небольшой кусок пластиковой трубки (ПЭ-10 НКТ) с тупыми краями и прикрепите два небольших весов (1 г, например, использование Эппендорф трубки, наполненные водой) на каждом конце. С весом свободно висит над стержня, ДМС должны быть немедленно окклюзии. Кроме того, когда вес облегчение, окклюзия ДМС прекращается сразу. Успешное ДМС окклюзии должны быть подтверждены немедленному изменению цвета судна от светло-красного до темно-фиолетового, изменение цвета миокарда поставляется сосуд (от ярко-красного до белого), а также наличие ST-повышение уровня ЭКГ. Во время реперфузии, изменения цвета мгновенно исчезают. Держите сердце мокрым от 37 ° С, солевые замачивают, кусок ваты по всему (см. также рисунок 1). Выбери себе ишемии время, по вашим основным интересом. На самом деле, для изучения эффектов кардиопротекторное ИС, было бы идеально использовать ишемии время, связанное с инфарктом в размерах от 30 до 40% от AAR. Таким образом, можно было бы продемонстрировать изменения в обоих направлениях, например, меньшие размеры инфаркта сердечной IP или больших размеров инфаркта с экспериментальными терапевтическими или удаления конкретных генов. Кроме того, мыши с инфарктом размером менее 50% обычно выживают эксперимент, в то время как инфаркт размеров от 60 до 80%, часто не выжил и животные умирают до реперфузии время будет завершена. Используя наши модели 10 минут ишемии миокарда, затем 2 часа реперфузии привести размер инфаркта в 3,5 ± 1,3% от AAR. В отличие от ишемии в течение 60 минут приводит к среднему размеру инфаркта на 42 ± 5,2% от AAR (р <0,01) 39. Итак, рассмотрим 60 минут ишемии как идеальные для изучения изменений в обоих направлениях. Тем не менее, вы, возможно, придется скорректировать ишемии время в геном мышей с целевой разорвать фенотипа. Выберите подходящее время реперфузии. Реперфузии время является критически важным для окрашивания ТТС. Бесцветный краситель сводится к кирпично-красного цвета осадок от дегидрогеназ в присутствии кофермента NADH. Умирающие клетки теряют способность удерживать NADH и, следовательно, очерчены, как бледная районов в пределах красных окрашенных жизнеспособным миокард. Инфаркт размер разграничение по TTC требует, чтобы NADH был вымывается полностью от некротических области. Однако, если реперфузии не достаточно долго, инфаркт разграничения размера путем окрашивания ТТС может привести к недооценке фактического размера инфаркта 43. В наших руках, после ишемии в течение 60 мин, инфаркт измерения размера увеличилась с 11,5 ± 4,5% после 30 минут до 42,2 ± 5,1%после 120 минут. Нет дальнейшее увеличение размера инфаркта могут быть обнаружены с более длинными реперфузии раза (240 минут) 39. Таким образом, мы рекомендуем 2 часа реперфузионного периода, который также представляется разумным в контексте сердечной determination.If фермента вы считаете ишемии предварительной подготовки, мы рекомендуем 4 цикла ИС (5 мин ишемии, 5 мин реперфузии), а затем ишемии в течение 60 мин и реперфузии время 2 часа. В этих условиях, IP был связан с 3,2-кратное снижение на размер инфаркта с 42,2 ± 5,1% до 13,3 ± 3,3% от AAR 39. Однако из-за висит вес системы, различные предварительной полки могут быть легко применены. 3. Определение площади, подверженной риску (AAR) и инфаркт Размер Инфаркт После индукции инфаркта миокарда (с или без IP), область перфузии по ДМС (площадь под угрозой, AAR) и размер инфаркта сама будет определяться использованием окрашивания техники. Впоследствии, инфаркт будет рассчитываться как процент от инфаркта миокарда по сравнению с AAR. Чтобы это сделать, описано выше технике двойного окрашивания синий и triphenyltetrazolium хлорида Эвана (ТТК) используется 44. Определите AAR по ретроградной инъекцией 1% синего красителя Эванса в аорту при ДМС является окклюзии. Или же, если катетер сонной находится в месте, использовать этот маршрут для инъекций Эванс синий. Эванс синий окрасит все инфаркт синих тканей, за исключением AAR. Крайне важно, чтобы этот шаг, чтобы избежать воздушных пузырьков внутри катетера, как они будут вводится в коронарное кровообращение и предотвратить синего окрашивания Эвана. До окрашивания Эванса синего вы можете собрать кровь для измерения сердечных ферментов. Кроме того, удаление крови путем инъекций 5 мл физиологического раствора через аорты или сонной катетера рекомендуется. Акцизный сердца и мыться в ледяной 0,9% физиологического раствора Добавить в 2% агарозном. Не используйте горячую агарозы, так как это будет препятствовать успешной окрашивание. Через 30 минут при температуре +4 ° С (или 15 минут от -20 ° C), разрезать на кусочки сердца в 1 мм с помощью матрицы сердца или микротоме. Если поместить сердце в морозильник избегать сухого замораживания что приведет к не окрашенных сердца. Инкубируйте ломтики с 1% TTC при температуре 37 ° С в течение 10 мин с использованием 15 мл синяя шапка на водяной бане. Это позволит инфаркта области, чтобы быть разграничены, как белые области, а жизнеспособные ткани пятна красного цвета. Зафиксируйте окрашенных срезов 10% fomaldehyde за ночь. Поступая таким образом, область инфаркта лучше контрастирует улучшения качества картинки. Определить площадь, подверженная риску (AAR) и размер инфаркта с помощью планиметрии с помощью программного обеспечения NIH Image 1,0 45. Рассчитать процент инфаркта миокарда с площади в опасности. 4. Сердечная Измерение Фермент Из-за ограничений, связанных с окрашиванием TTC мы рекомендуем в качестве дополнительной отсчет для инфаркта миокарда тяжести определения сердечного тропонина I (cTnI) в сыворотке мышей. Кровь будет получено из воротной вены и сывороточные уровни cTnI затем определяются с количественными быстрого анализа cTnI (Life Diagnostics, Inc, Уэст-Честер, штат Пенсильвания, США). 5. Представитель Результаты: Рисунок 1. () Модель сердечной IP использованием висит вес системы коронарной окклюзии. Этот метод не требует узел для коронарной окклюзии. (В, С) Хирургические установки. (D) Изображение мышиной сердце с левой коронарной артерии (ДМС, стрелки) после окклюзии. Визуальная идентификация ДМС необходимо для перевязки и ишемической предварительной подготовки у мышей. 8,0 нейлона шов, расположенных вокруг мм ДМС 1-2 ниже левого предсердия. Шва с резьбой через небольшую пластиковую трубку (*). Конце каждого шва крепится к малым весом (1 г) и шов находится над стержни с обеих сторон. (Е) Определение AAR после ДМС окклюзии и ретроградной инъекцией синего красителя Эванса в аорту. AAR остаются неокрашенными время как остальная часть миокарда синий. После инкубации AAR ткани с ТТК, инфаркта запятнанную область белым, а красным жизнеспособной окрашенных тканей.