Genel notlar: Tüm işlemler dik bir diseksiyon mikroskobu (Olympus, Z-Eksen Crank Post STU2 StandBoom Stand ile SZX10) altında yapılan bir cerrahi koagülatör ile yapılmalıdır. Havalandırma prosedürü için kritik öneme sahiptir ve bu nedenle belirli bir miktar zaman ventilatör seçme ve havalandırma tekniği optimize harcanan olmalıdır. Sıcaklık, kan basıncı ve anestezi boyunca sabit olmalıdır. 1. Anestezi, Entübasyon ve İzlenmesi C57BL / 6 farelerin en az 10 hafta kullanın. Bir doz 70 mg / kg vücut ağırlığı ip pentobarbital sodyum kullanarak neden anestezi anestezi yaklaşık 10 mg / kg / saat sodyum pentobarbital ile koruyun. Bu kan basıncını önemli ölçüde azaltabilirsiniz doz aşımı ile dikkatli olun. Pentobarbital yeniden dozlama sonra bile plazma düzeylerinde ciddi artışlara yol saat-. Kardiyoprotektif bileşik olarak izofluran ilgili güçlü kanıtlar dayanarak, 'soy' ve miyokard iskemisi 46-56 için bir model pentobarbital kurulan kullanmanızı öneririz . 37 vücut ısısını korumak için termal geribildirim denetleyicisine bağlı bir rektal termometre probu ile sıcaklık kontrollü ısıtmalı masa (RT, Effenberg, Münih, Almanya) ° C Yeri fareler Bir teyp ve ayak bileklerine kadar bağlanmış bir dikiş kullanarak tabloya bağlı üst ve alt ekstremite ile supin pozisyonda, anestezi indüksiyon güvenli fareler sonra. Dişler kullanarak kafa için de aynı işlemi yapın. Yeterli frenleyici başarılı bir entübasyon ve kontrollü bir cerrahi için önemlidir. Ameliyat öncesinde, fare saç alerji riskini azaltmak için, mineral yağ ile fare kaplayın. Cerrahi trakea ortaya çıkarmak ve trakeal entübasyon bluntpolyethylene kanüller (Insyte 22g, Beckton Dickinson, ABD) kullanarak gerçekleştirmek. Iğne künt bir stile olarak kullanmak mümkün olacak. Bir çift forseps kullanılarak dil çekin ve daha sonra vücudun doğru 15 derecelik bir açıyla yavaşça itin. Trakea bile maruz kaldıktan sonra bir mikroskop kullanılarak, bazı eğitim gerektirebilir. Trakea küçük bir hasar sütür boyunca hayvan havalandırılması yetersizlik sebep olacağının farkında olun. Bu nedenle, hava yolu problemleri karşılaşırsanız, küçük delikler için trakea kontrol edin. Doğru tüp yerleştirme carina yukarıdaki önceden maruz trakea içinde kanül doğrudan görselleştirme onaylayın. Tüpün bir vantilatör bağlayın. Biz Siemens (PRM Veteriner, ABD) Servo 900 C kullanarak bir basınç kontrollü ventilasyon tekniği tavsiye ederiz. Hayvanlar daha sonra FiO 2 = 0.4 ile 110 solunum / dk 10 mbar, frekans pik inspiratuar basınç ve 3-5 mbar bir pozitif ekspirasyon sonu basınç kullanarak havalandırılmalıdır. Ayarları açık toraks cerrahisi sırasında akciğerlere kontrol ederek en kolay elde edilebilir bazı ayarlamalar gerekebilir. Akciğerler çökmüş ya da aşırı genişlemiş emin olun. Servo 900 C, insanlar için vantilatör olarak inşa olduğu gerçeğine rağmen, bir basınç kontrollü ventilatör ortamda kullanılması farelerin havalandırma için mükemmel çalışır. I-STAT kullanarak ventilasyon süresi 4 ila 6 saat sonra normal gaz değişimi (oksijen kısmi basıncı, PaO 2, 115 ± 15 mmHg ve kısmi basınç karbon dioksit, PaCO 2 38 ± 6 mmHg) onaylamak için kan gazı analizi yapın Sistemi (Abbott, ABD). Monitör EKG (örneğin, Hewlett Packard, Böblingen, Almanya) ile kalp atım hızı. Kalp hızı 450 altına düştüğü olmadığından emin olun. Fare oluşursa bradikardi sıcaklık ve anestezi dozu / konsantrasyon kontrol edin. Xylacin / Ketamin anestezisi 250 / dk bir kalp neden olur ve bu nedenle tavsiye edilmez. Uygun bir sıvı replasmanı uygulayın. Olan bir infüzyon serum fizyolojik 0.1 ml / saat arteriyel ya da venöz kateter yoluyla iskemi başlangıcından önce yapılmalıdır. Ayrıca, 500 ul tuzlu bolus cerrahi öncesi ip verilebilir. Thoractomy bir damla kan basıncı uyarabilir ve ilave olarak serum fizyolojik boli gerekebilir. Iskemi sonra, 1 ml / saat infüzyon hızı, ortalama arteryel kan basıncı 60 mmHg üzerinde korumak ve yeterli reperfüzyon TTC kullanarak infarkt boyama için kritik bir garanti etmek için gerekli olabilir. Kan basıncı sürekli kayıt için karotis arter (PE10, İpucu OD (mm / "Konik)> 0,024 mm/.011") yerleştirin. Karotis arter paratrakeal kasların künt diseksiyon ile maruz kalacaklar. Daha fazla maruz kalma ve herhangi bir doku travması (özellikle vagal sinir) dikkatli kaçınma ardından, iki sütür ve küçük bir kelepçe kullanılarak damar içine bir kateter yerleştirilir. Arter diseksiyon başlamadan önce vücut kol takın. Bu arter uzun bir parça gösterecektir. Karotis arter proksimalinde Knot sonuna. Sütür sonuna kadar büyük bir kelepçe takıngerilim elde edilir. Arter çevresinde başka bir dikiş yerleştirin ve çok distal ucu arter disseke. Burada, küçük bir kelepçe yerleştirin. Arter içine bir küçük çapraz açılış kesmek için mikro makas kullanın. Ince bir forseps (Dumont, TEFE) ile açılış tutun ve ellerinizi / forseps ile uygun büyüklükte kateter önceden. Ikinci sütür ile düğüm yapın ve arter güvenli. Kelepçe gevşetin ve kateter daha önceden. Kateter birkaç knot ve bant ile sabitleyin. 2. Koroner Arter Tıkanıklığı Tekniği Cildi inceleyin ve künt diseksiyon tekniği kullanılarak sol toraks duvar maruz. Koter ile toraks duvarı açığa çıkarmak için kasları Pektoral binbaşı ve küçüklerin kesin. Pektoralis majör çekerek, akciğer böylece elektrocerrahi üniteden bir forseps, akciğer, Yırtılmaları koagüle geçen yatay bir çizgi üzerinde 1-3 mm eklenen ve, damla. Köreldiğini makas kullanarak, toraks duvar kesti. Catch plaka kaldırılır ve künt ucu bükülmüş Modifiye çengelli iğne, toraks açık tutmak için kullanılır. Sütür son yerleştirilmesini kolaylaştırmak için, koagüle ve göğüs kafesinin sol alt tarafına doğru diyafram boyunca toraks duvar kesmek. Perikard diseksiyon kalp Açığa. Diyafragma hareketleri önlemek için kaldırmak ve frenik sinir kesmek. Bir forseps ile küçük bir ıslak pamuk çubuğu kullanın ve kalbin sağ tarafına doğru çevirin. Sol koroner arter (LCA) belirlenmesi ve akciğerleri çok şişirilmiş olduğunu emin olun. Optimize toraks açılış dikiş verirken kalp güvenli tutun. Kan basıncı çok düşükse belirlenmesi karmaşık olabilir. Salin Ek boli LCA belirlenmesi artırabilirsiniz. LCA, yatay olarak kalp kapısı (dönen damarlar aksine) parlak kırmızı bir gemi. Bazen, LCA bir mikroskop olmadan en iyi görülür. Çok fazla ışık kullanmayın. Bu görselleştirme imkansız hale yansımaları koparmaya yol açabilir. LCA görsel olarak tespit edildikten sonra, 8.0 naylon sütür (Prolen Ethicon, Notiefies, ABD) LCA etrafında bir yer. Aralıklı LCA oklüzyon amaçla, kardiyomiyopati (42) asılı bir ağırlık sistemi kullanarak kronik bir model benimsedi . Künt kenarlı plastik tüp küçük bir parça (PE-10 tüp) ile dikiş ipliği ve her iki ucunda iki küçük ağırlıklar (1g, su ile dolu örneğin kullanımı Eppendorf tüpleri) ekleyin. Özgürce bir çubuk üzerinde asılı ağırlıkları ile LCA hemen tıkalı olmalıdır. Buna ek olarak, ağırlık rahatladım, LCA oklüzyon tek seferde iptal edilir. Başarılı LCA oklüzyon, koyu mor, gemi (parlak kırmızı beyaz) ve EKG ST yükselme varlığı tarafından sağlanan miyokard renk değişikliği kırmızı ışık geminin hemen bir renk değişikliği ile teyit edilmesi gerekir. Reperfüzyon sırasında, renk değişiklikleri anında kaybolur. 37 ° C, emici pamuk tuzlu batırılmış, parça boyunca (bkz. Şekil 1 de) ile kalp ıslak tutun. Birincil ilgi göre iskemi zamanı seçti. Aslında, çalışmalar için IP kardiyoprotektif etkileri, bir infarkt boyutları yaklaşık 30 -% 40 AAR ile ilgili bir iskemi zamanı kullanmak için ideal olacaktır. Böylece, her iki yönde de değişiklik, örneğin kalp IP veya deneysel bir tedavi ya da belirli bir gen delesyonu ile büyük infarkt boyutları ile küçük infarkt boyutları göstermek için mümkün olacaktır. Buna ek olarak, 60 ila% 80 arasında infarkt boyutları genellikle hayatta ve reperfüzyon süresi tamamlanmadan önce hayvanlar ölür ise% 50'den daha az bir infarkt olan fareler genellikle, deney hayatta. 3.5 infarkt 2 saat reperfüzyon sonucu miyokard iskemi modeli, 10 dakika ±% 1.3 AAR kullanma. Buna karşılık, 60 dakika 42 ortalama infarkt sonuçları iskemi zamanı AAR (p <0.01) 39 ±% 5.2. Böylece, her iki yönde de değişiklik çalışmak için ideal olarak 60 dakika iskemi düşünün. Bununla birlikte, sever fenotip gen hedeflenen farelerde iskemi zamanını ayarlamak için olabilir. Sağ reperfüzyon zamanı seçti. Reperfüzyon TTC boyama için büyük önem taşımaktadır. Renksiz boya, tuğla-kırmızı renkli bir çökelti, co-enzim NADH varlığında dehydrogenases tarafından düşürüldü. Dying hücreleri NADH ve bu nedenle, kırmızı lekeli canlı miyokardın içinde soluk alanlar olarak tarif korumak için yeteneklerini kaybederler. TTC tarafından infarkt tarif bu NADH nekrotik alan tamamen yıkanmış olmuştur gerektirir. Ancak reperfüzyon yeterince uzun değilse, TTC boyama infarkt tarif gerçek infarkt 43 küçümsenmesi neden olabilir. Bizim ellerde, 60 dakika iskemi zamanı sonra, infarkt ölçümü 11.5 arttı ± 42,2 ila 30 dakika sonra% 4.5 ±% 5.1120 dakika sonra. Infarkt daha fazla artış reperfüzyon kez daha uzun (240 dakika) 39 ile tespit edilebilir. Böylece, iskemi önkoşullamanın düşünün kardiyak enzim determination.If bağlamında da makul görünüyor 2 saat reperfüzyon süresi tavsiye ederiz, biz 60 iskemi zamanı takip, 4 kür IP (5 dakika iskemi, 5 dakika reperfüzyon) tavsiye dk ve 2 saat reperfüzyon süresi. Bu koşullar altında, IP 42.2 infarkt 3.2 kat azalma ± 5.1% 13.3 ± 3.3 AAR 39% ile ilişkili bulunmuştur. Ancak, asılı ağırlık sistemi sayesinde, farklı önkoşullamanın alayları kolaylıkla uygulanabilir olabilir. 3. 'Risk Altında' Alanının Belirlenmesi (AAR) ve Miyokard Enfarkt Boyutu Miyokard infarktüsü (IP ile veya olmadan) indüksiyonundan sonra, bölgede LCA (riskli alan, AAR) ve kendisi bir boyama tekniği kullanılarak tespit edilecektir infarkt boyutunu perfüze. Daha sonra, infarkt sonra AAR göre, miyokard enfarktüsü yüzdesi olarak hesaplanan olacaktır. Bunu yapmak için, Evan mavi ve triphenyltetrazolium klorür (TTC) ile daha önce açıklanan bir çift boyama tekniği 44 kullanılır . LCA tıkalı ise retrograd aort içine% 1 Evan mavi boya enjeksiyonu ile AAR belirleyin. Alternatif olarak, bir karotis kateter yerinde kalırsa, Evans mavi enjeksiyon için bu yolu kullanın. Evans mavi AAR hariç, tüm miyokard doku mavi boya. Koroner dolaşımı içine enjekte edilir ve Evan mavi boyama engel olduğu gibi, kateter içinde hava kabarcıkları önlemek için bu adım için kritik öneme sahiptir. Evans mavi boyama önce kardiyak enzim ölçümleri için kan toplamak için isteyebilirsiniz. Buna ek olarak, aort ya da karotis kateter aracılığıyla 5 ml serum fizyolojik enjekte edilerek kan kaldırılması tavsiye edilir. Buz gibi% 0.9 salin Vergi kalp ve yıkama % 2 agaroz içine gömün. Bu başarılı boyama önleyecek sıcak agaroz kullanıyor musunuz. 30 dakika sonra +4 ° C (veya 15 dakika -20 ° C), kalp, kalp matrisi veya mikrotom kullanılarak 1 mm dilimler halinde kesilir. Kalp dondurucu içine koyarsanız olmayan lekeli kalplerine yol açacaktır kuru dondurma kaçının. Az% 1 TTC ile 37 dilim inkübe ° C su banyosunda 15 ml mavi kapaklı kullanarak 10 dk. Bu süre canlı doku lekeleri enfarkte alan kırmızı, beyaz bir alan olarak sınırları belirgin olmasını sağlayacaktır. Gece boyunca% 10 fomaldehyde ile boyandı dilim sabitleşmek. Bunu yaparak, enfarkte alanda daha iyi resim kalitesini iyileştirmek tezat. Risk altındaki alanı (AAR) ve NIH yazılım Resim 1.0 45 planimetri ile infarkt belirleyin. Risk altındaki alanı enfarkte miyokardın yüzde hesaplayın. 4. Kardiyak Enzim Ölçümü TTC boyama ile ilgili sınırlamalar nedeniyle miyokard infarktüsü şiddeti kardiyak troponin I (cTnI) farelerin serum düzeyleri belirlenmesi için ek okuma olarak tavsiye ederiz. Kan daha sonra nicel bir hızlı cTnI assay (Hayat Diagnostics, Inc, West Chester, PA, USA) ile belirlenir portal ven ve serum cTnI seviyeleri elde edilecektir. 5. Temsilcisi Sonuçlar: Şekil 1 koroner oklüzyonu asılı ağırlık sistemi kullanarak kalp IP (A) Model. Bu teknik, koroner oklüzyon için bir düğüm gerektirmez. (B, C) Cerrahi kurulum. (D), sonra sol koroner arter oklüzyon fare kalp (LCA, oklar) Resim. LCA Görsel kimlik, fareler ligasyonu ve iskemik ön için gerekli. LCA 1-2 mm çapında bir 8.0 naylon dikiş sol kulak kepçesi altına yerleştirilir. Dikiş, küçük bir plastik tüp (*) geçirilir. Her dikiş sonunda küçük bir ağırlığı (1g) bağlı olduğu ve her iki tarafta dikiş çubuklar üzerine yerleştirilir. (E) LCA oklüzyon ve retrograd aort içine Evan mavi boya enjeksiyonu sonra AAR belirlenmesi. Miyokardın geri kalanını mavi ise AAR boyasız kalır. Inkübasyondan sonra TTC enfarkte alan boyanmış beyaz AAR doku, canlı doku boyanmış kırmızı.