概要

Cultures organotypiques d'hippocampe Slice

Published: February 03, 2011
doi:

概要

Nous décrivons une méthode pour préparer organotypiques coupes d'hippocampe qui peut être facilement adaptée à d'autres régions cérébrales. Tranches de cerveau sont fixées sur les membranes poreuses et milieux de culture est autorisée à former une interface. Cette méthode préserve l'architecture brute de l'hippocampe pour 2 semaines de culture.

Abstract

L'hippocampe, une composante du système limbique, joue un rôle important dans la mémoire à long terme et de la navigation spatiale 1. Neurones de l'hippocampe peut modifier la force de leurs connexions, après de brèves périodes de forte activation. Ce phénomène, connu sous le nom de potentialisation à long terme (LTP) peuvent durer des heures ou des jours et est devenu le mécanisme de meilleur candidat pour l'apprentissage et la mémoire 2. De plus, l'anatomie bien définis et la connectivité de l'hippocampe 3 a fait un système modèle classique pour étudier la transmission synaptique et la plasticité synaptique 4.

Comme notre compréhension de la physiologie des synapses hippocampiques a grandi et est devenu acteurs moléculaires identifiés, un besoin de manipuler des protéines synaptiques est devenu impératif. Organotypiques cultures hippocampiques offrent la possibilité de manipulation génétique simple et précise intervention pharmacologique, mais maintenir l'organisation synaptique qui est essentiel pour comprendre le fonctionnement des synapses dans un contexte plus naturaliste que la routine des méthodes de culture neurones dissociés.

Nous présentons ici une méthode pour préparer et la culture des coupes d'hippocampe qui peut être facilement adaptée à d'autres régions cérébrales. Cette méthode permet un accès facile à des tranches de manipulation génétique en utilisant des approches différentes comme une infection virale ou biolistique 5,6 7. En outre, les tranches peuvent être facilement récupérées pour des analyses biochimiques 8, ou transférés à des microscopes pour l'imagerie 9 ou 10 expériences électrophysiologiques.

Protocol

1. Avant de commencer la préparation des coupes d'hippocampe. Préparer la trancheuse tissus en plaçant un morceau de feuille de téflon et le montage d'une nouvelle lame. Essuyez la culture de tissus (TC) hotte avec 70% d'éthanol et de mettre à l'intérieur microscope à dissection. Stériliser le capot, un microscope, trancheuse tissus et tous les instruments de dissection pendant 15 minutes avec la lumière UV. Préparez six des plaques TC. Ajouter 750 ul de milieux …

Discussion

Cette méthode est basée sur la première méthode décrite par Stoppini et al. 11 et offre une manière rapide à des tranches de la culture d'hippocampe. L'aspect le plus important de ce protocole est de maintenir les tranches stériles, c'est pourquoi il est essentiel d'utiliser les techniques appropriées de stériles et de bien désinfecter et stériliser tout le matériel en contact avec le tissu.

Différentes sources de sérums peuvent influencer l…

開示

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Ce travail a été financé par le NINDS – NIH R01NS060756

Materials

Material Name タイプ Company Catalogue Number Comment
Cell culture inserts   Millipore PICM03050  
6 well plates   BD Falcon 353046  
Tissue Slicer   Stoelting 51425/51415  
Microscope   Olympus SZX7-ILLD2-100  
Hippocampus dissecting tool   F.S.T 10099-15  
Large utility scissors. Perfection   F.S.T 37500-00/37000-00 Right/ Left handed  
Iris Spatula   F.S.T 10093-13  
Straight spatula   F.S.T 10094-13  
Rounded spoon micro spatula   VWR 57949-039  
Dissecting single cutting edge needle   Electron Microscopy Science 72946  
Dissecting tweezers   Dummont #2  
Small dissecting scissors   F.S.T 14060-10  
MEM Eagle medium   Cellgro 50-019 PB  
Horse serum heat inactivated   Invitrogen 26050-88  
L-Glutamine (200 mM)   Invitrogen 25030081  
CaCl2 (1 M)   Sigma C3881  
MgSO4 (1 M)   Sigma M2773  
Insulin (1 mg/ml), dissolved in HCl 0.01 N   Sigma I0516  
Ascorbic Acid, solution (25%)   Sigma A4544  
D-Glucose   Sigma G5767  
NaHCO3   Sigma S6014  
Hepes   Sigma H7523  
Sucrose   Sigma S5016  
Phenol Red Solution 0.5% in DPBS   Sigma P0290  
KCl   Sigma P3911  
MgCl2 (1 M)   Sigma M9272  

参考文献

  1. Martin, S. J., Grimwood, P. D., Morris, R. G. Synaptic plasticity and memory: an evaluation of the hypothesis. Annu Rev Neurosci. 23, 649-711 (2000).
  2. Bliss, T. V., Collingridge, G. L., Morris, R. G. I. n. t. r. o. d. u. c. t. i. o. n. Long-term potentiation and structure of the issue. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 358, 607-611 (2003).
  3. Shepherd, G. M. . The synaptic organization of the brain. , (2004).
  4. Malinow, R., Tsien, R. W. Presynaptic enhancement shown by whole-cell recordings of long-term potentiation in hippocampal slices. Nature. 346, 177-180 (1990).
  5. Malinow, R. Introduction of green fluorescent protein (GFP) into hippocampal neurons through viral infection. Cold Spring Harb Protoc. , (2010).
  6. Shi, S., Hayashi, Y., Esteban, J. A., Malinow, R. Subunit-specific rules governing AMPA receptor trafficking to synapses in hippocampal pyramidal neurons. Cell. 105, 331-343 (2001).
  7. Woods, G., Zito, K. Preparation of gene gun bullets and biolistic transfection of neurons in slice culture. J Vis Exp. , (2008).
  8. Esteban, J. A. PKA phosphorylation of AMPA receptor subunits controls synaptic trafficking underlying plasticity. Nat Neurosci. 6, 136-143 (2003).
  9. Mainen, Z. F. Two-photon imaging in living brain slices. Methods. 18, 231-239 (1999).
  10. Barria, A., Malinow, R. Subunit-specific NMDA receptor trafficking to synapses. Neuron. 35, 345-353 (2002).
  11. Stoppini, L., Buchs, P. A., Muller, D. A simple method for organotypic cultures of nervous tissue. J Neurosci Methods. 37, 173-182 (1991).
  12. Simoni, A. D. e., Griesinger, C. B., Edwards, F. A. Development of rat CA1 neurones in acute versus organotypic slices: role of experience in synaptic morphology and activity. J Physiol. 550, 135-147 (2003).

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記事を引用
Opitz-Araya, X., Barria, A. Organotypic Hippocampal Slice Cultures. J. Vis. Exp. (48), e2462, doi:10.3791/2462 (2011).

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