κ-Carrageenan Sub-Microgel Medium을 사용한 조직 유사 구조의 임베디드 바이오프린팅
Summary
이 연구는 새로운 κ-carrageenan 서브 마이크로겔 현탁액 수조를 소개하여 놀라운 가역적 재밍-언재밍 전이 특성을 보여줍니다. 이러한 특성은 임베디드 3D 바이오프린팅에서 생체 모방 조직 및 장기를 구성하는 데 기여합니다. 고해상도와 세포 성장으로 심장/식도 유사 조직의 성공적인 프린팅은 고품질 바이오프린팅 및 조직 공학 응용 분야를 보여줍니다.
Abstract
입상 하이드로겔 지지 수조를 사용하는 임베디드 3차원(3D) 바이오프린팅은 생체 모방 스캐폴드를 만들기 위한 중요한 기술로 부상했습니다. 그러나 정밀한 바이오잉크 증착과 세포 생존력 및 기능의 균형을 맞추는 적절한 겔 현탁액을 엔지니어링하는 것은 특히 원하는 점탄성 특성을 달성하는 데 있어 여러 가지 과제를 제시합니다. 여기에서 새로운 κ-카라기난 겔 지지 수조는 작동하기 쉬운 기계적 분쇄 공정을 통해 제작되어 균일한 서브 마이크로 스케일 입자를 생성합니다. 이 서브 마이크로겔은 항복 응력이 작고 빠른 전단 희석 특성을 가진 전형적인 Bingham 유동 거동을 나타내어 바이오잉크의 원활한 증착을 용이하게 합니다. 또한, κ-카라기난 마이크로겔 네트워크의 가역적 겔-졸 전이 및 자가 치유 기능은 인쇄된 구조물의 구조적 무결성을 보장하여 정의된 구조적 특징을 가진 복잡한 다층 조직 구조를 생성할 수 있습니다. 인쇄 후, κ-carrageenan 서브 마이크로겔은 간단한 인산염 완충 식염수 세척으로 쉽게 제거할 수 있습니다. 세포가 함유된 바이오잉크를 사용한 추가 바이오프린팅은 생체모방 구조 내의 세포가 92%의 높은 생존율을 가지며 가성발구를 빠르게 확장하며 강력한 증식을 유지한다는 것을 보여주며, 이는 조직 및 장기 제조를 위한 이 바이오프린팅 전략의 잠재력을 나타냅니다. 요약하면, 이 새로운 κ-카라기난 서브 마이크로겔 배지는 엔지니어링 조직 및 장기의 체외 개발에 중대한 영향을 미치는 탁월한 품질의 임베디드 바이오프린팅을 위한 유망한 방법으로 부상하고 있습니다.
Introduction
전기방사 섬유, 다공성 스폰지 및 폴리머 하이드로겔을 포함한 조직 공학 지지체는 세포 성장, 조직 재생 및 장기 기능 복원을 지원하는 구조적 프레임워크를 제공하여 손상된 조직 및 장기의 복구 및 재건에 중추적인 역할을 합니다 1,2,3. 그러나 전통적인 골격은 기본 조직 구조를 정확하게 복제하는 데 어려움을 겪어 공학적 조직과 자연 조직 간의 불일치로 이어집니다. 이러한 한계는 결함이 있는 조직의 효율적인 치유를 방해하며, 보다 정확한 생체 모방을 달성하기 위해 골격 설계의 발전이 시급히 필요하다는 점을 강조합니다. 3차원(3D) 바이오프린팅은 생체 재료 잉크와 세포를 사용하여 복잡한 생체 조직 구조를 층별로 정밀하게 구성하는 혁신적인 제조 기술입니다4. 다양한 생체 재료 중에서 고분자 하이드로겔은 세포의 현장 캡슐화를 촉진하고 결정적으로 세포의 성장을 지원하는 독특한 네트워크를 갖춘 이상적인 바이오잉크로 부상하고 있습니다 5,6. 그럼에도 불구하고, 많은 부드럽고 수분이 풍부한 하이드로겔은 바이오잉크로 사용될 때 프린팅 과정에서 인쇄된 스캐폴드 구조의 흐릿함 또는 급격한 붕괴를 유발하는 경향이 있습니다. 이 문제를 해결하기 위해 임베디드 3D 바이오프린팅 기술은 마이크로겔 배스를 지지 재료로 사용하여 정밀하고 부드러운 바이오잉크 증착을 가능하게 합니다. 하이드로겔 바이오잉크의 겔화 후, 마이크로겔 배스를 제거하여 복잡한 구조를 가진 정제된 바이오닉 스캐폴드를 얻습니다. 젤라틴 7,8, 아가로스9 및 젤란 검10,11과 같은 재료는 임베디드 3D 바이오프린팅을 위한 마이크로겔 배스를 만드는 데 사용되어 조직 공학에서 소프트 하이드로겔의 적용을 크게 발전시켰습니다. 그러나 이러한 미립자 겔의 미크론 수준 및 불균일한 입자 크기는 3D 프린팅의 해상도와 충실도에 해로운 영향을 미칩니다 12,13,14. 작고 균일하게 분산된 입자로 젤 같은 현탁액 플로트를 제작해야 하는 시급한 필요성이 있으며, 이는 충실도가 높은 바이오프린팅을 달성하는 데 이점을 제공합니다.
이 프로토콜에서는 임베디드 3D 프린팅을 위해 균일한 서브미크론 수준의 새로운 희생 과립 κ-카라기난 현탁액 수조가 제공됩니다. 빠른 재밍-언재밍 전이의 이 혁신적인 서브 마이크로겔 수조 거동은 높은 구조적 충실도를 가진 생체 모방 하이드로겔 지지체의 정밀한 제작을 용이하게 합니다15. 이 새로운 현탁 매체를 활용하여 다층 조직 구조를 특징으로 하는 일련의 생체 모방 조직 및 장기 구조가 성공적으로 인쇄되었으며, 젤라틴 메타크릴레이트와 실크 섬유 메타크릴레이트로 구성된 복합 바이오잉크를 사용합니다. 이 연구에서 우리는 식도를 3D 바이오프린팅 생체모방 대상으로 선택한 주된 이유는 식도가 다층 조직 구조를 가지고 있을 뿐만 아니라 근육층이 내부 원형 및 외부 종방향 복합 층 구조를 나타내기 때문입니다. 이러한 층의 적절한 정렬과 구성을 보장하는 것은 기능적 조직 재생에 필수적입니다. 따라서 우리는 식도의 다층 구조를 복제하기를 매우 원합니다. 더 중요한 것은 κ-carrageenan 서브 마이크로겔을 현탁액 수조로, GelMA/SFMA를 바이오잉크로 사용하여 조직 공학을 위한 생체 모방 스캐폴드를 설계하고 구성했다는 것입니다. 인쇄된 식도는 반복적인 인산염 완충 식염수 세척으로 쉽게 방출될 수 있습니다. 또한, κ-카라기난 서브 마이크로겔 수조는 세포독성 물질이 없어 높은 세포적합성을 보장합니다15. 이방성 지지체 내에 로드된 평활근 세포는 주목할 만한 확산 활동을 나타냅니다. 이 균일한 서브 마이크로겔 현탁 매체는 임베디드 3D 바이오프린팅을 통해 복잡한 조직과 장기를 제작할 수 있는 새로운 방법을 제공합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
바이오프린팅에 사용하기 위한 κ–카라기난 서브 마이크로겔 현탁액 배스의 준비는 생성된 배지가 바이오잉크를 지지하는 데 필요한 특성을 나타내도록 하기 위한 몇 가지 중요한 단계를 포함하는 신중하게 조정된 프로세스입니다. 처음에, κ–카라기난 용액은 κ–카라기난 분말을 고온에서 탈이온수에 용해시켜 균질한 혼합물을 생성함으?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
본 연구는 닝보자연과학재단(2022J121, 2023J159), 닝보시 자연과학재단 핵심프로젝트(2021J256), 푸단대학교(Fudan University) 고분자분자공학 국가핵심연구소 개방재단(K2024-35), 중국 저장성 죽상동맥경화성 질환 정밀의학핵심연구소(2022E10026)의 지원을 받았다. 핵심 시설, 닝보 대학의 건강 과학 센터에 의한 기술 지원에 감사드립니다.
Materials
| 3D bioprinter | Custom-designed | ||
| 4’,6-Diamidino-2-Phenylindole | Solarbio Life Science | C0065 | Ready-to-use |
| 405 nm UV light | EFL | XY-WJ01 | |
| Cell Counter | Corning | Cyto smart 6749 | |
| Confocal laser scanning microscope | Leica | STELLARIS 5 | |
| DMEM high glucose | VivaCell | C3113-0500 | High Glucose, with Sodium Pyruvate and L-Glutamine |
| Dynamic rotational rheometer | TA Instrument | Discovery HR-20 | |
| Esophageal smooth muscle cells | Supplied by the Department of Cell Biology and Regenerative Medicine, Health Science Center, Ningbo University | Primary cells from the rabbit esophagus | |
| Fetal bovine serum | UE | F9070L | |
| Fluorescein isothiocyanate labeled phalloidin | Solarbio Life Science | CA1610 | 300T |
| Gelatin methacrylate | EFL | EFL-GM-60 | 60% substitution |
| k-carrageenan | Aladdin | C121013-100g | Reagent grade |
| Lithium Phenyl (2,4,6-trimethylbenzoyl) phosphinate | Aladdin | L157759-1g | 365~405 nm |
| Live-Dead kit | beyotime | C2015M | |
| Microplate reader | Potenov | PT-3502B | |
| Paraformaldehyde | Solarbio Life Science | P1110 | 4% |
| Penicillin/streptomycin | Solarbio Life Science | MA0110 | 100 ´ |
| Phosphate buffered saline | VivaCell | C3580-0500 | pH 7.2-7.4 |
| Silk fibroin methacrylate | EFL | EFL-SilMA-001 | 39% substitution |
| Triton X-100 | Solarbio Life Science | T8200 | |
| Trypsin-EDTA | VivaCell | C100C1 | 0.25%, without phenol red |
Riferimenti
- Xu, X., et al. Biodegradable engineered fiber scaffolds fabricated by electrospinning for periodontal tissue regeneration. J Biomater Appl. 36 (1), 55-75 (2021).
- Amann, E., et al. A graded, porous composite of natural biopolymers and octacalcium phosphate guides osteochondral differentiation of stem cells. Adv Healthcare Mater. 10 (6), e2001692 (2021).
- Afjoul, H., et al. Freeze-gelled alginate/gelatin scaffolds for wound healing applications: An in vitro, in vivo study. Mater Sci Eng C. 113, 110957 (2020).
- Hasanzadeh, R., et al. Biocompatible tissue-engineered scaffold polymers for 3D printing and its application for 4D printing. Chem Eng J. 476, 146616 (2023).
- Fu, L., et al. Cartilage-like protein hydrogels engineered via entanglement. Nature. 618 (7966), 740-747 (2023).
- Bertsch, P., et al. Self-healing injectable hydrogels for tissue regeneration. Chem Rev. 123 (2), 834-873 (2023).
- Hinton, T. J., et al. Three-dimensional printing of complex biological structures by freeform reversible embedding of suspended hydrogels. Sci Adv. 1 (9), e1500758 (2015).
- Wang, S., et al. 3d bioprinting of neurovascular tissue modeling with collagen-based low-viscosity composites. Adv Healthcare Mater. 12 (25), e2300004 (2023).
- Sreepadmanabh, M., et al. Jammed microgel growth medium prepared by flash-solidification of agarose for 3d cell culture and 3d bioprinting. Biomed Mater. 18 (4), 045011 (2023).
- Zeng, J., et al. Comparative analysis of the residues of granular support bath materials on printed structures in embedded extrusion printing. Biofabrication. 15 (3), 035013 (2023).
- Terpstra, M. L., et al. Bioink with cartilage-derived extracellular matrix microfibers enables spatial control of vascular capillary formation in bioprinted constructs. Biofabrication. 14 (3), 034104 (2022).
- Compaan, A. M., et al. Gellan fluid gel as a versatile support bath material for fluid extrusion bioprinting. ACS Appl Mater Inter. 11 (6), 5714-5726 (2019).
- Compaan, A. M., Song, K., Chai, W., Huang, Y. Cross-linkable microgel composite matrix bath for embedded bioprinting of perfusable tissue constructs and sculpting of solid objects. ACS Appl Mater Inter. 12 (7), 7855-7868 (2020).
- Zhang, H., et al. Direct 3D printed biomimetic scaffolds based on hydrogel microparticles for cell spheroid growth. Adv Funct Mater. 30 (13), 1910573 (2020).
- Zhang, H., et al. Cation-crosslinked κ-carrageenan sub-microgel medium for high-quality embedded bioprinting. Biofabrication. 16, 025009 (2024).
- Lee, A., et al. 3d bioprinting of collagen to rebuild components of the human heart. Science. 365 (6452), 482-487 (2019).
- Yao, J., et al. Slightly photo-crosslinked chitosan/silk fibroin hydrogel adhesives with hemostasis and anti-inflammation for pro-healing cyclophosphamide-induced hemorrhagic cystitis. Mater Today Bio. 25, 100947 (2024).
- Senior, J. J., et al. Agarose fluid gels formed by shear processing during gelation for suspended 3d bioprinting. J Vis Exp. (195), e64458 (2023).
- Roche, C. D., et al. durability, contractility and vascular network formation in 3d bioprinted cardiac endothelial cells using alginate-gelatin hydrogels. Front Bioeng Biotech. 9, 63657 (2021).
- Wang, D., et al. Microfluidic bioprinting of tough hydrogel-based vascular conduits for functional blood vessels. Sci Adv. 8 (43), (2022).
- Shao, L., Hou, R. X., Zhu, Y. B., Yao, Y. D. Pre-shear bioprinting of highly oriented porous hydrogel microfibers to construct anisotropic tissues. Biomater Sci. 9 (20), 6763-6771 (2021).
