ここでは、マウスの骨、骨髄、胸腺、およびヒト胸腺組織から間質細胞を単離することを可能にするプロトコルを紹介します。
シングルセルシーケンシングにより、造血器官の間質における不均一な細胞集団のマッピングが可能になりました。これらの方法論は、定常状態でのこれまで未解決の不均一性、および外因性ストレスまたは老化中に誘発される細胞タイプの表現の変化を研究するためのレンズを提供します。ここでは、マウスとヒトの胸腺、およびマウスの骨と骨髄から高品質の間質細胞集団を単離するための段階的なプロトコルを紹介します。これらのプロトコルで単離された細胞は、高品質のシングルセルマルチオミクスデータセットの生成に適しています。ここでは、サンプル消化、造血系数の枯渇、FACS解析/ソーティングの影響、およびこれらの要因がシングルセルシーケンシングとの適合性にどのように影響するかについて説明します。シーケンシング後の解析における解離の成功と非効率性、および下流の間質細胞収量を示すFACSプロファイルの例を用いて、ユーザーにとって認識可能なポインタを提供します。間質細胞の特定の要件を考慮することは、この分野の知識を進歩させる高品質で再現性のある結果を得るために重要です。
健康な成人では、血液細胞のde novo産生は骨髄と胸腺で起こります。これらの部位にある間質細胞は造血の維持に必須であるが、間質は組織の1,2,3,4の1%未満を構成する。したがって、間質を支える造血の純粋な分離株を得ることは、特に高品質のサンプルを得るために適切な処理を必要とするシングルセルマルチオミクスにとって、大きな課題となります。異なる消化カクテルの成分は、マルチオミクス解析の特定のステップを妨げる可能性があります5,6。ここで紹介するプロトコルは、骨髄および胸腺組織からの多種多様な間質細胞の単離を詳述しています。
骨髄と胸腺の両方における間質成分の摂動は、血球の発達に深刻な混乱をもたらし、悪性腫瘍を引き起こす可能性があります7,8,9。間質を支える造血は、細胞傷害性コンディショニングおよび骨髄移植後に損傷を受け、その結果、造血幹細胞および前駆細胞(HSPC)を維持するサイトカインおよび成長因子の分泌が減少します2,10,11。さらに、老化は骨髄と胸腺間質細胞に影響を及ぼし、老化した造血表現型に寄与する可能性があります。胸腺は、加齢に伴う広範な退縮を経験する最初の臓器です。脂肪と線維性組織は、思春期の発症という早い時期にT細胞支持間質に置き換わり始めます12,13。骨髄では、脂肪細胞含有量は年齢とともに増加し、血管および骨内膜のニッチは大幅に再構築されます14,15,16。
複数のストレス状態にわたる造血支持間質の研究を可能にするため、またヒト組織とマウス組織の両方の胸腺の場合、以前に発表された消化プロトコル 1,2,8,17,18 を最適化しました。これらのプロトコルは、細胞の効率的で再現性のある単離を保証し、シングルセルRNAシーケンシング(scRNAseq)やその他のタイプのマルチオミクスと互換性があります。
造血器官の間質細胞は正常な血液産生に不可欠であり、造血間質の摂動は造血の維持とストレスに対する応答に深刻な障害をもたらす可能性があります9,23,24。造血間質細胞への洞察は、血液疾患7,9,10,24を理解し、それらに対?…
The authors have nothing to disclose.
私たちは、マサチューセッツ総合病院のHSCI-CRMフローサイトメトリー施設とハーバード大学のバウアーコア施設から専門的な技術支援を受けました。T.K.とK.Gはスウェーデン研究評議会、C.M.はドイツ研究財団の支援を受けました。シングルセルRNAシーケンシングデータの解析にご協力いただいたSergey Isaev氏とI-Hsiu Lee氏に感謝いたします。
0.25% Trypsin-EDTA | Thermo Fisher Scientific | 25200-072 | |
7AAD (7-aminoactinomycin D) | BD Biosciences | 559925 | |
Anti-Human Lineage Cocktail 3-FITC | BD Biosciences | 643510 | |
Bovine Serum Albumin | Millipore Sigma | A9647 | |
C57Bl/6 mice | Jackson | 664 | Males or females, 8-12 weeks old |
Calcein | Fisher Scientific | 65-0853-78 | |
Collagenase IV | Millipore Sigma | C5138 | |
Corning Sterile Cell Strainers, White, Mesh Size: 70 µm | Fisher Scientific | 08-771-2 | |
DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dilactate) | Biolegend | 422801 | |
Dispase II | Thermo Fisher Scientific | 17105041 | |
Dnase I Solution | Thermo Fisher Scientific | 90083 | 2500 U/mL |
Easysep mouse streptavidin RapidSpheres Isolation kit | StemCell Technologies | 19860 | |
Fetal Bovine Serum | Gibco | A31605-01 | Qualified One Shot |
Human Fc Block | BD Biosciences | 564220 | |
Liberase TM | Millipore Sigma | 5401127001 | Research Grade |
Medium 199 | Gibco | 12350 | |
Mouse anti-human CD235a-BV77 | BD Biosciences | 740785 | |
Mouse anti-human CD31-PE/Dazzle594 | Biolegend | 303130 | |
Mouse anti-human CD45-BV77 | Biolegend | 304050 | |
Mouse anti-human CD4-BV605 | BD Biosciences | 562658 | |
Mouse anti-human CD66b-FITC | BD Biosciences | 555724 | |
Mouse anti-human CD8-APC/Cy7 | BD Biosciences | 557760 | |
Mouse anti-human EpCam-BV421 | Biolegend | 324220 | |
Protector RNase Inhibitor | Millipore Sigma | 3335402001 | |
Rat anti-mouse CD105-PE /dazzle594 | Biolegend | 120424 | |
Rat anti-mouse CD11b-Biotin | Biolegend | 101204 | |
Rat anti-mouse CD140a-APC | Fisher Scientific | 17-1401-81 | |
Rat Anti-Mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block) | BD Biosciences | 553142 | |
Rat anti-mouse CD31-BUV737 | BD Biosciences | 612802 | |
Rat anti-mouse CD31-BV421 | Biolegend | 102424 | |
Rat anti-mouse CD3-Biotin | Biolegend | 100244 | |
Rat anti-mouse CD45.2-Biotin | Biolegend | 109804 | |
Rat anti-mouse CD45-PE/Cy7 | Biolegend | 103114 | |
Rat anti-mouse CD45-PE/Cy7 | Biolegend | 103114 | |
Rat anti-mouse CD45R/B220-Biotin | Biolegend | 103204 | |
Rat anti-mouse CD51-PE | Biolegend | 104106 | |
Rat anti-mouse EpCam-BV711 | BD Biosciences | 563134 | |
Rat anti-mouse Ly-6A/E(Sca-1)-AF700 | Biolegend | 108142 | |
Rat anti-mouse Ly-6G/Ly-6C(Gr1)-Biotin | Biolegend | 108404 | |
Rat anti-mouse Ter119-Biotin | Biolegend | 116204 | |
Rat anti-mouse Ter119-PE | Biolegend | 116208 | |
Rat anti-mouse Ter119-PE/Cy7 | Biolegend | 116222 | |
Stemxyme | Worthington Biochemical | LS004107 |