면역형광 이미징은 복잡하고 시간에 따라 달라지는 생물학적 과정을 단 한 번의 스냅샷으로 관찰할 수 있는 능력에 제약을 받습니다. 이 연구는 정밀하게 절단된 쥐의 턱밑샘 절편에 대해 수행된 실시간 이미징 접근 방식을 간략하게 설명합니다. 이 접근법을 통해 항상성 중 세포-세포 상호 작용과 재생 및 복구 과정을 실시간으로 관찰할 수 있습니다.
타액선 재생은 다양한 세포 유형 간의 복잡한 상호 작용을 포함하는 복잡한 과정입니다. 최근 연구는 대식세포가 재생 반응을 유도하는 데 중추적인 역할을 한다는 것을 밝혔습니다. 그러나 이 중요한 역할에 대한 우리의 이해는 주로 고정 조직 생검에서 얻은 정적 견해에 의존해 왔습니다. 이러한 한계를 극복하고 이러한 상호 작용에 대한 통찰력을 실시간으로 얻기 위해 이 연구에서는 타액선 조직 체외 배양 및 세포 이동의 실시간 이미지를 캡처하기 위한 포괄적인 프로토콜을 간략하게 설명합니다.
프로토콜에는 몇 가지 주요 단계가 포함됩니다: 먼저, 쥐의 턱밑 타액선 조직을 비브라톰을 사용하여 조심스럽게 절단한 다음 공기-액체 계면에서 배양합니다. 예를 들어, 이러한 절편은 세포 손상을 유도하고 재생 반응을 유발하기 위해 방사선 노출을 통해 의도적으로 손상될 수 있습니다. 관심있는 특정 세포를 추적하기 위해 특정 단백질이 녹색 형광 단백질 (GFP)로 표시된 유전자 변형 마우스에서 수집 된 타액선 조직을 활용하는 것과 같이 내인성 라벨을 붙일 수 있습니다. 대안적으로, 형광 접합 항체를 사용하여 관심의 특정 세포 표면 마커를 발현하는 세포를 염색할 수 있습니다. 일단 준비되면, 타액선 절편은 12시간 동안 high-content confocal imaging system을 사용하여 15분 간격으로 캡처된 이미지와 함께 실시간 이미징을 받습니다. 그런 다음 결과 이미지를 컴파일하여 동영상을 만들고, 이후 분석하여 중요한 세포 동작 매개변수를 추출할 수 있습니다. 이 혁신적인 방법은 연구자들에게 부상 후 타액선 내의 대식세포 상호 작용을 조사하고 더 잘 이해할 수 있는 강력한 도구를 제공하여 이 역동적인 생물학적 맥락에서 작용하는 재생 과정에 대한 지식을 발전시킵니다.
대식세포는 재생과 복구 과정에서 점점 더 중요한 역할을 하는 것으로 나타났으며, 기존의 면역 기능을 넘어서는 것으로 나타났습니다 1,2. 실제로, 대식세포는 재생과 관련된 수많은 과정에 관여하며, 흉터 형성 및 섬유증뿐만 아니라 복구의 모든 단계에서 중요한 조절 활동을 나타냅니다 3,4. 조직 상주 대식세포는 다양한 세포 표현형을 유도하는 복잡한 메커니즘을 가진 매우 이질적인 세포 유형이며 장기 발달, 기능 및 항상성에 필수적인 역할을 합니다(5에서 검토). 조직 상주 대식세포는 처음에 난황낭과 태아 간의 전구체에서 발생하며, 이후 기존 대식세포의 수명과 이들이 상주하는 조직 또는 틈새에 따라 다양한 속도로 증식 또는 골수 유래 혈액 단핵구로 대체됩니다 6,7.
중요한 것은 조직에 상주하는 대식세포가 모든 조직에 분산되어 다양한 장기 기능에 기여한다는 것입니다. 틈새 특정 기능을 수행하기 위해 미세 환경에 의해 고유하게 프로그래밍됩니다. 이러한 이유로, 조직 내 대식세포의 국소화는 폐, 유선, 장, 피부 및 근육에서 관찰되는 독특한 개체군과 함께 대식세포의 기능에 대한 통찰력을 제공합니다 8,9,10. 유선이 발달하는 동안, 유관 대식세포는 유관 나무와 밀접하게 연관되어 있으며, 유관 대식세포의 고갈은 분지(branching)를 현저히 감소시킨다11. 또한, 대식세포는 사춘기 중 형태 형성과 임신 중 폐포 형성에 필요하며, 상피를 적극적으로 모니터링합니다. 근육 손상의 경우, 대식세포의 특정 집단이 손상 부위 내에 “거주”하여 줄기 세포 증식에 필요한 증식 유도 신호를 제공하는 일시적인 틈새 시장을 제공합니다. 따라서, 그들은 복구 과정을 관장하는 데 있어 뚜렷한 대식세포 집단의 특수한 역할을 나타낸다2. 폐에서도 간질성 대식세포가 IL-1B12의 방출을 통해 손상 관련 일시적 전구세포로 전환하기 위해 인터루킨(IL)-R1-R1 발현 폐포 II(AT2) 세포를 프라이밍하는 유사한 현상이 발생합니다. 또한, 최근 연구에 따르면 대식세포는 방사선 조사 후 쥐의 턱밑 타액선(SMG)의 재생에 필수적이며, 대식세포가 없으면 상피 재생이 방해를 받는다13. 종합하면, 이 데이터는 조직 손상 후 일시적인 염증성 틈새와 항상성 동안 대식세포 활성화 및 기능의 중요성을 강조합니다.
대식세포는 활성 세포이며, 그 기능은 직접 세포 간 접촉(14,15)을 포함한 다양한 세포 유형과의 상호 작용뿐만 아니라 틈새 조절에 필수적인 수용성 인자 2,16의 분비와 같은 보다 간접적인 방법을 포함합니다. 고전적 면역형광 이미징은 이러한 상호작용을 밝히는 데 유용하지만, 시간상 단일 스냅샷만 묘사하여 매우 역동적인 재생 과정에 중요한 수많은 시점을 생략함으로써 한계가 있습니다17,18. 타이밍의 중요성과 다양한 재생의 물결의 출현이 더욱 뚜렷하게 부각됨에 따라 이러한 과정을 더 자세히 분석하는 것이 필수적입니다.
방사선 치료는 암 진단을 받은 많은 사람들의 생명을 구하는 치료법입니다. 방사선 치료는 종양을 축소하거나 제거하는 데 효과적이지만, 방사선장에 있는 건강한 조직을 손상시키고 면역 반응을 유도할 수도 있습니다. 방사선 손상은 빠른 대식세포 모집 및 직간접적인 면역 조절 반응을 유도할 수 있다19,20. 타액선은 두경부암 치료 중에 종종 부주의하게 조사되어 상피 손상, 세포 위축 및 섬유증23,24 또는 만성 구강 건조증을 초래한다25.
타액선은 상피세포(타액을 생성하는 침샘 세포와 타액을 운반하는 유관 세포 모두), 근상피 세포, 상피 전구 세포, 신경, 혈관, 면역 세포, 섬유아세포 및 세포외 기질(ECM)을 포함하되 이에 국한되지 않는 다양한 세포 유형과 구조로 구성되어 있습니다. 재생 반응에서 이러한 세포 유형 중 많은 것의 역할 및 반응은 이전에 26,27,28,29,30에서 설명되었다. 그러나 이러한 서로 다른 세포가 항상성과 재생 중에 어떻게 상호 작용하는지, 특히 대식세포와 같은 면역 세포가 어떻게 행동하는지에 대해서는 잘 연구되지 않았습니다. 이 원고는 SMG 대식세포와 생체 외 조직에서 관심 있는 다른 세포 간의 실시간 상호 작용을 연구하기 위해 새로 확립된 방법을 설명합니다. SMG는 비브라톰에서 슬라이스되고, 표면 마커를 염색하고, 최대 12시간 동안 이미징됩니다. 이 방법을 사용하면 대식세포에 의한 주변 세포의 식세포작용을 관찰할 수 있고, 대식세포 이동 역학을 연구할 수 있으며, 대식세포와 상피세포 간의 직접적인 세포 간 상호작용을 입증할 수 있습니다.
타액선 조직을 체외에서 배양할 수 있는 능력은 항상성과 손상 반응의 맥락에서 세포 간 상호 작용을 연구할 수 있는 훌륭한 기회를 제공합니다. 마우스 턱밑샘의 생체 내 이미징이 가능하지만39,40, 이 기술은 관심 세포를 내인성으로 라벨링하기 위해 형광 리포터 마우스 모델을 사용하는 것에 의존하며 말단 마취 하에 수행되어야 합니다. 여기에서, 생체 외(ex vivo)에서 턱밑 분비선 절편을 배양하여 세포 구조 및 세포-세포 상호작용을 유지하는 방법이 설명된다. 이 접근 방식은 현재의 라이브 이미징 기술을 개선하고 생체 내 이미징에 대한 대안을 제공합니다.
이 기술을 사용한 조직의 장기 유지는 공기-액체 계면에서 절편을 배양하는 데 의존합니다. 이전의 이식 모델(26, 41)은 단지 며칠 동안만 배양에 성공했을 가능성이 높은데, 이는 그것들이 매질에 잠겨서 본질적으로 “질식”했기 때문이다. 대조적으로, 공기-액체 인터페이스 배양 시스템을 사용하면 조직 건강과 구조를 장기간 유지하여 고품질 이미징을 보장합니다. 이미징 전에 소량의 매체를 사용하고 공간이 제한된 챔버 내에 SMG 슬라이스를 장착하여 슬라이스를 평평하게 유지하는 방법은 이 기술의 성공에 필수적입니다. 이 분석에서 세포의 시각화는 내인성으로 표지된 리포터 마우스 또는 형광 접합 항체에 따라 달라집니다. 형질전환 형광 리포터 마우스 모델과 특정 세포 유형 및 subset을 표적으로 하는 접합 항체가 풍부하기 때문에 이 방법은 다양한 세포 특이적 상호 작용을 탐색하는 데 적합합니다.
이 방법은 in vivo13에서 발생하는 것과 유사하게 상피내 및 ex vivo 방사선 조사 손상으로 인해 acinar 및 ductal structure 위축을 초래하는 조직의 좋은 모델을 제공하지만, 일부 요소는 ex vivo에서 재현할 수 없습니다. 여기에는 혈관 조직 및 신경 입력의 기능 부족과 침투 염증 세포의 부재가 포함됩니다. 타액선 항상성 및 재생에서 혈관과 신경의 역할이 잘 문서화되어 있고26,42 타액선 기능, 부상 반응, 감염 및 쇼그렌 증후군(SS) 발병기전에서 T세포 및 B세포와 같은 이동 면역세포(43)의 중요성을 감안할 때(44에서 검토됨), 이 분석법은 몇 가지 중요한 세포 상호작용을 놓칠 수 있습니다. 또한 자연살해(NK) 세포45 및 수지상 세포(DC) 46 이동과 같은 매우 빠른 이동 이벤트는 15분마다 이미징하여 놓칠 수 있습니다. 그러나 이미징 간격은 관심 있는 특정 세포-세포 상호 작용을 연구하도록 최적화할 수 있으며, z-stack을 통해 3차원으로 이미징할 수 있는 기능을 통해 3D 세포 이동을 평가할 수 있습니다. 이미징 중에 조직을 안전하게 장착하는 것은 세포 추적 측정과 같은 정량화에 매우 중요합니다. 또한, 이 연구는 마우스 조직을 활용했지만, 이 프로토콜은 인간 타액선에서 세포 간 상호 작용을 연구하기 위한 실행 가능한 방법을 제공하여 다른 방법으로는 얻을 수 없는 귀중한 번역 정보를 생성합니다.
항상성과 재생에서 조직 상주 대식세포의 역할은 여러 조직 2,10,11,12에서 입증되었지만, 침샘에서의 대식세포의 역할은 대부분 밝혀지지 않았습니다. 대식세포가 방사선 조사 손상 후 상피 재생에 필수적이라는 것은 알려져 있지만13 이 효과의 기저에 있는 정확한 메커니즘은 아직 알려져 있지 않다. 타액선 절편의 실시간 이미징을 통해 기존 컨포칼 이미징에서 놓치는 경우가 많은 복잡한 조직 역학을 실시간으로 시각화하고 분석할 수 있습니다. 추가적으로, 대식세포는 생체내에서 다양한 기능을 수행하면서 형상의 동적 변화를 겪는다는 것이 명백하며, 이 프로토콜은 고정 조직에서의 전형적인 정적 보기보다 이러한 변화의 더 나은 표현을 제공할 가능성이 높다. 향후 연구에서는 이 기술을 활용하여 항상성, 손상 및 재생/해결 과정에서 세포 간 통신이 어떻게 변하는지 조사할 수 있습니다. 이 접근법은 궁극적으로 치료 효과를 제공할 수 있는 주요 신호 전달 경로와 사건을 설명하는 데 유용합니다.
The authors have nothing to disclose.
SE는 Wellcome Trust 보조금 108906/Z/15/Z로 자금을 지원합니다. EE는 UKRI/MRC 보조금 MR/S005544/1과 University of Edinburgh의 Chancellor’s Fellowship에서 자금을 지원합니다. 그림 1A는 BioRender.com 로 작성되었습니다.
0.4 µm filter cell culture inserts (Nunc) | Avantor/VWR | 734-2240 | Inserts pre-packed in 6-well multidishes, 20 mm × 25 mm |
24 well plate | Corning | 3524 | |
35 mm dish | Falcon | 353001 | |
6 well plate | Corning | 3516 | |
Coverslips | Paul Marienfeld GmbH & Co. KG | 111650 | Deckglaser Cover Glasses 25 mm diameter |
Double-sided sticker | Grace Bio-Labs | 654004 | SecureSeal Imaging Spacers SS1 x 13, 13 mm diameter x 0.12 mm depth, 25 mm x 25mm OD |
EtOH | Scientific Laboratories Supplies | CHE1924 | Absolute ethanol (EtOH) AR, 99.7% |
F4/80 antibody | Invitrogen | 17-4801-82 | F4/80 Monoclonal Antibody (BM8), APC, eBioscience |
Forceps | Fine Science Tools | 91113-10 | Student Fine Forceps Straight Broad Shanks |
Glass bottom 6 well plate | Cellvis | P06-1.5H-N | 6 well glass bottom plate with high performance #1.5 cover glass |
Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) | Life Technologies | 14025050 | +calcium +magnesium, no phenol red |
Hoechst | Sigma Aldrich | 14533 | Alternative name: bisBenzimide H 33342 trihydrochloride |
Ice box | Fisher Scientific | 11339623 | Azlon Polyurethane Ice Buckets with Lid |
Imaging and analysis software | Harmony | ||
Low Melting Agarose | Merck | A9414-25G | |
Paintbrush | Watercolour brush, 10 mm x 2mm tip | ||
Penicillin-Streptomycin | Sigma Aldrich | P4333 | 10,000 units penicillin and 10 mg streptomycin/mL, 0.1 μm filtered |
Phosphate Buffered Saline (PBS) | Life Technologies | 20012027 | |
RPMI | ThermoFisher | 12634010 | Gibco Advanced DMEM/F-12 |
Scalpel | Swann-Morton | Disposable scalpels, No. 11 blade | |
Scissors | Fine Science Tools | 14088-10 | Extra Narrow Scissors 10.5 cm |
Shepherd Mark-I-68A 137Cs irradiator | JL Shepherd & Associates | ||
Superglue | Bostik | Multi-purpose superglue, fast setting, ultra strong | |
Vibratome | Leica | Leica VT 1000 S | |
Vibratome blades | Astra | Superior Platinum Double Edge blade | |
Wild-type (C57BL/BJ) mice | Charles River |