唾液腺における細胞間相互作用の Ex Vivo Live Cell Imaging(英語)

顎下唾液腺の損傷に対するマクロファージの応答は不明のままです。これには、腺内の特定の構造に局在して移動するかどうか、および移動する距離と速度が含まれます。これは、静的イメージングアプローチでは判断が困難でした。 これに対処するために、マクロファージと上皮細胞の相互作用をリアルタイムで研究するためのライブイメージングアプローチが開発されました。スライスの免疫蛍光染色は、内在的に標識された系統追跡マウスモデルと組み合わせました(図1A および 図2A)。このモデルでは、スライスを10Gyのガンマ線照射に曝露して照射傷害を誘発し、照射後2時間、3日後、4日後に画像化(IR)し、非照射スライスを対照とした。データは、Hoechst(光毒性を最小限に抑えるためにレーザー425を使用)、GFP(488)、dTomato(561)、およびAlexa 647(640)の4つのチャネルから取得しました。zスタックを行い、2〜3μmごとに画像を撮影し、合計30〜40面を収集することで、全高80〜90μmとした。 この手法を用いて、膜結合型トマト(mT)シグナルとカスパーゼ3/7活性を解析したところ、器官型スライスは上皮構造を保持し、培養中で生存し、細胞死が最小限に抑えられることが明らかになりました。このデータは、7日間培養したR26mTmGマウス32の顎下腺の非照射スライスが、mTシグナルと上皮構造を保持していることを示しました(図1B)。しかしながら、ex vivo照射の3日後には、腺房および乳管細胞の萎縮が明らかであり(図1B;腺房構造および乳管構造は、それぞれ白と緑の破線で強調表示されている)、in vivo放射線傷害と一致した13。アポトーシスは、非照射スライスではごくわずかであったが、照射後4日目には、照射スライスにカスパーゼ3/7+細胞の証拠が見られ(図1C;緑色の矢印)、in vivo傷害33,34と同様であった。さらに、照射されたスライスは、照射されていない対照と比較してγH2AX38の上昇によって示されるように、in vivo DNA損傷34、35、36、37を再現しました(図1D、E)。したがって、器官型唾液腺切片は培養中で良好な生存率を示し、放射線照射に対してin vivo組織と同様に応答した。 これに続いて、リアルタイムの細胞間相互作用が調査されました。GFP標識上皮前駆細胞(Krt14CreER-GFP)と直接相互作用するマクロファージを、IR後3日目の12時間にわたって観察しました(図2A および ビデオ1)。驚くべきことに、マクロファージは上皮前駆細胞に何時間も接近し、しばしば12時間のイメージング期間全体にわたって接触していることが明らかになりました。さらに、マクロファージによる上皮細胞のリアルタイム貪食が観察され、マクロファージがスライス培養モデルにおいて従来の機能を果たしていることが確認されました(図2B、 動画2 、 動画3)。また、この手法により、マクロファージはホメオスタシス中も放射線損傷後も比較的静止していることが同定されましたが、これはおそらく組織内での高密度によるものと考えられます。これは、唾液腺マクロファージが恒常性維持中や照射損傷後に広範囲に遊走しないことを初めて実証した。しかし、マクロファージは有意な移動を示さなかったが、周囲の組織は照射後に動態の増加を示し、複数のマクロファージが標識上皮細胞のクラスターの周りで活発に相互作用した。さらに、核染色のみに基づいて、この手法により、経時的にスライス内の細胞の動きを視覚化することができ、多くの場合、管全体が組織内で「移動」しているように見えます(ビデオ4)。培養の過程で時間の経過とともに、スライスが平らな形状から回転楕円体のような形態にシフトすることが明らかになり、スライス内の細胞の動きは、潜在的な再編成イベントに似た球状構造への再配列によるものである可能性が高いことが示唆されました。 最後に、このアッセイによって生成されたライブイメージングデータを使用して、遊走などの細胞挙動を定量的に測定できます。個々の細胞を検出してセグメント化し(図3A)、市販のイメージングおよび解析ソフトウェアを使用して移動を測定できます( 材料表 および ビデオ5を参照)。さらに、最近傍物解析を行うことで、細胞(この場合はマクロファージ)が他の目的細胞(この場合は Krt14CreER-GFP+細胞)に接近するかどうか、およびこの動態が経時的にどのように変化するかを判断することができます(図3B)。 図1:精密に切断された唾液腺組織切片におけるin vivo応答の再現。(A)実験プロトコルの概略図。(B)新鮮な顎下腺(SMG)組織、7日間培養した未操作のSMGスライス、または3日または7日前に10Gyガンマ線を単回照射したSMGスライスから得られた膜結合トマトの代表的な画像。白の破線はアシナ構造の例を示し、緑の破線はダクト構造の例を示す。スケールバー = 50 μm。 (C)2時間前または4日前に10Gyガンマ線を単回照射した未操作のSMGスライスまたはSMGスライスから得られたカスパーゼ-3/7発現の代表画像。緑色の矢印は正の原子核を示します。スケールバー = 50 μm。 (D)3日前に10Gyガンマ線を単回照射した未操作のSMGスライスまたはSMGスライスから得られたγH2AX発現の代表画像。スケールバー = 20 μm。 (E)2時間前と3日前に10Gyガンマ線を単回照射した未操作SMGスライスまたはSMGスライスからのEpCAM+上皮細胞におけるγH2AXの代表的な発現。SSA = 側方散乱領域。この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。 図2:マクロファージ-上皮細胞相互作用と食作用のライブイメージング。 (A)照射後のKRT14+前駆細胞とその子孫(Krt14CreER-GFP+細胞)とマクロファージとの相互作用の連続静止画。ライブセルイメージングは、90分間の細胞動態を捉えます。スケールバー = 20 μm。関連ビデオは ビデオ 1 です。(B)上皮細胞を貪食するマクロファージの連続静止画。ライブセルイメージングは、60分間のプロセスを示します。白い矢印はマクロファージを指し、黄色の矢印は貪食を受けている細胞の核を示しています。スケールバー = 50 μm。関連ビデオは ビデオ 2 です。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。 図3:細胞動態解析のためのライブイメージング。 (A)遊走などの細胞挙動パラメータを解析するための個々の細胞の同定とセグメンテーションを示す画像( ビデオ5を参照)。細胞は、個々の細胞とトラックを区別するためにランダムに疑似色付けされます。スケールバー = 100 μm。 (B)10の時点(5分ごとに撮影された画像)をプロットした、個々の Krt14CreER-GFP+細胞に最も近い物体までの距離(μm単位)の定量化。ウェルあたりの平均値として表示されるデータ。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。 ビデオ1:照射後のKRT14+前駆細胞/子孫とマクロファージの間の動的相互作用を明らかにするライブイメージング。スライスは、ライブイメージングの前に10Gyのガンマ線を1回照射した。 Krt14CreER-GFP+細胞は緑色、マクロファージ(F4/80+)は赤色、核はシアンで表されています。このビデオは、12時間の培養期間にわたる単一のzスタックで構成されており、15分ごとに画像が撮影されています。 動画2:上皮細胞を包み込むマクロファージを捉えたライブイメージング。マクロファージ(F4/80+)は赤色、核はシアンで示しています。ビデオは単一のzスタックで構成され、12時間の培養期間にまたがり、15分ごとに撮影された画像があります。 ビデオ3:上皮細胞を包み込むマクロファージを示す最大投影ライブイメージング。マクロファージ(F4/80+)は赤色、核はシアンで表示しています。このビデオは、最大80μmのzスタック画像を投影し( ビデオ2では1つの平面を提示)、12時間の培養期間にまたがり、15分ごとに画像を撮影しています。 動画4:放射線照射後の培養における唾液腺上皮の動的挙動を示すライブイメージング。スライスは、ライブイメージングの前に10Gyのガンマ線を1回照射した。マクロファージ(F4/80+)は赤色、核はシアンで表されます。このビデオは、12時間の培養期間にわたる単一のzスタックで構成されており、15分ごとに画像がキャプチャされています。 動画5:経時的な細胞遊走の定量的追跡。このビデオでは、ライブイメージングビデオから細胞の痕跡を個別にトレースする方法を紹介します。矢印はセルの軌跡を示し、セルは個別に擬似色付けされます。ビデオは単一のzスタックで構成され、15分ごとに撮影された画像で1時間の培養期間にまたがっています。