オルガノイド-線維芽細胞共培養は、 in vivo 幹細胞ニッチを研究するためのモデルを提供します。ここでは、食道オルガノイド-線維芽細胞共培養のためのプロトコルについて説明する。さらに、ホールマウントイメージングを使用して、線維芽細胞とオルガノイドの相互作用を視覚化します。
上皮幹および前駆細胞は、生涯を通じて上皮バリアの形成および維持に寄与する。ほとんどの幹細胞および前駆細胞集団は、解剖学的に異なる場所に隠れており、ステム性を維持するニッチシグナルとの排他的な相互作用を可能にします。上皮オルガノイド培養の開発は、恒常性および疾患における幹細胞および前駆細胞の役割を理解するための強力なツールを提供するが、ニッチ環境内での相互作用はほとんど存在しないため、幹細胞の挙動に影響を与える因子の同定が妨げられている。線維芽細胞は、上皮幹と前駆細胞の運命を指示する上で重要な役割を果たします。ここでは、食道前駆細胞の再生および分化における線維芽細胞亜集団の描写を可能にする包括的なオルガノイド-線維芽細胞共培養プロトコルが提示される。このプロトコルでは、食道から上皮細胞と線維芽細胞の両方を並行して単離する方法が記載されている。トランスジェニックレポーターまたは野生型マウスのいずれかから食道前駆細胞と線維芽細胞亜集団の両方を単離するための明確な蛍光活性化細胞選別戦略が概説されています。このプロトコルは、特定の線維芽細胞亜集団の単離に対応するために適応できる汎用性の高いアプローチを提供します。食道上皮オルガノイド単培養の確立と継代がこのプロトコルに含まれているため、共培養システムとの直接比較が可能です。さらに、上皮-線維芽細胞相互作用の詳細な画像解析を可能にする3Dクリアリングアプローチについても説明します。まとめると、このプロトコルは、食道幹細胞ニッチ成分 をインビトロで同定および理解するための比較および比較的ハイスループットの方法を記載する。
オルガノイドは、幹細胞および前駆細胞の特性評価、ならびに幹細胞ニッチの細胞成分に由来するシグナル伝達の手がかりを理解するための3Dインビトロアッセイとして使用されます1,2,3,4。マウス食道オルガノイドは2014年に初めて記載され、いくつかの論文では、食道オルガノイドの維持と通過に必要なR-Spondin(RSPO)、NOGGIN、上皮成長因子(EGF)などの成長因子が特定されており5,6,7、in vivoにも同様のシグナル伝達の手がかりが必要であると主張しています。 前駆細胞の再生。しかしながら、成長因子は一般に非生理学的濃度で添加され、必ずしもin vivoシグナル伝達環境を反映しないオルガノイド増殖条件をもたらす。
線維芽細胞は、多くの幹細胞ニッチにおいて前駆細胞特性を支える不均一な間質細胞集団である8。上皮前駆細胞と線維芽細胞を同じオルガノイド培養に組み合わせることで、外因的に補充された成長因子の濃度を抑えたオルガノイド形成が可能になります。腸管および肝上皮由来のオルガノイド共培養系が記載されているが、食道オルガノイド-線維芽細胞共培養を確立するためのプロトコルは依然として優れている9、10、11。
このプロトコルでは、トランスジェニックPdgfrαH2BeGFPマウス12または古典的な抗体染色を有する野生型マウスのいずれかを使用して、食道からの線維芽細胞に対する2つの蛍光活性化細胞選別(FACS)戦略が概説されている。線維芽細胞の異なる亜集団は、選択した細胞表面マーカーを使用して単離することができ、それによってプロトコルに柔軟性を提供する。さらに、オルガノイド形態を保存する3D蛍光イメージング技術を使用して、線維芽細胞とオルガノイドの相互作用を特徴付けます。オルガノイドクリアリングは、オルガノイドの光透過深さを増加させる迅速な方法を提供し、オルガノイドと線維芽細胞の結合の視覚化を改善し、オルガノイド構造全体の再現を可能にします。このプロトコルは、食道オルガノイド共培養とホールマウントイメージング戦略を組み合わせて、線維芽細胞とオルガノイドの相互作用の機能的特性評価を可能にします。
ここで提示されたプロトコルは、機能的な食道上皮-線維芽細胞相互作用を調査するための in vitro モデルを確立します。
上皮層は間質から分離されており、上皮コンパートメントと間質コンパートメントの両方に対して最適化された解離プロトコルを可能にします。上皮解離プロトコルの最適化にもかかわらず、組織凝集塊は明らかなままです。15分ごとに激しく上下にピペッティングすると、塊の数とサイズが大幅に減少します。他のプロトコルは、トリプシンを使用して上皮層をさらに解離させる5、6。ここで、トリプシンの使用、または解離時間をさらに増加させることは、上皮細胞の生存率およびオルガノイド形成効率の低下をもたらす傾向があるので、推奨されない。上皮とは対照的に、間質は容易に解離し、解離溶液中で30分は~90%の線維芽細胞生存率を有する単一細胞懸濁液をもたらす(図1E)。プロトコルで上皮-ストーム分離ステップを除外すると、解離時間が大幅に増加し、線維芽細胞の生存率が低下し、上皮細胞の収量が低下します。さらに、間質から上皮を分離することで、共培養のセットアップ時に、各集団の細胞数を決定し、異なるマウス系統の上皮細胞と線維芽細胞を混合する機会が得られます。
オルガノイド増殖に対する線維芽細胞機能の研究は、幹細胞生物学において一般的に使用される方法である9,10,11,15,16。確立された共培養培地は、10%ウシ胎児血清(FCS)9,15を添加したDMEMまたは成長因子低減培地10,16のいずれかである。このプロトコルでは、成長因子還元培地を使用して、線維芽細胞が大部分静止しているin vivo幹細胞ニッチの状態を模倣します。FCSは、共培養において線維芽細胞の活性化および増殖をもたらす成長因子に富む血清であり、おそらくin vivo状態とは異なる線維芽細胞状態に対応する。FCSを除外し、成長因子を低減することにより、培地単独(ER低)がオルガノイド増殖を支持せず、線維芽細胞の増殖を刺激しないようにすることで、オルガノイド増殖に対する線維芽細胞の影響を単離することができる。この培地では、NOGGINが除去され、RSPOが最小限に抑えられます(10%RPSO)。NOGGINとRSPOの両方が食道オルガノイドの成長に不可欠であることが実証されています6。EGFは、それ自体ではオルガノイドの増殖をサポートしないため、共培養培地に保持されました。しかし、線維芽細胞は、EGF還元培地(E低R低;図2B、D)。
オルガノイド共培養は、トリプシン処理中に線維芽細胞が失われるため、継代によって持続することはできません。ただし、食道オルガノイドは維持、拡張し、単培養としてさらなる実験に使用できるため、オルガノイド継代がプロトコルに含まれていました。単培養からの継代オルガノイドは、新たに単離された線維芽細胞との共培養をセットアップするために使用できます。初代細胞を使用することの欠点は、複数のオルガノイド共培養をセットアップするために必要なマウスの数です。線維芽細胞の小さな亜集団に焦点を当てると、得られる共培養の数は限られています。他のプロトコルでは、線維芽細胞は、オルガノイド共培養をセットアップするために使用する前に、まず培養中で増殖される10。しかしながら、線維芽細胞は継代中に形態および同一性を変化させることを、一次皮膚および心臓線維芽細胞を用いることによって示される17、18。食道線維芽細胞の従来の2D継代は、形態と表現型の両方の変化をもたらし、線維芽細胞の in vitro 濃縮は、内因性幹細胞ニッチの表現コピーを目的とした共培養には適していないことを示しています。
ホールマウント染色は、線維芽細胞とオルガノイドの相互作用を維持および視覚化するためのツールを提供します。すべてのオルガノイドが線維芽細胞に直接付着しているわけではありませんが、ほとんどのオルガノイドは線維芽細胞と接触していることに注意してください( 図2Cを参照)。上皮-線維芽細胞の相互作用を維持するためには、オルガノイドの取り扱いに注意し、激しいピペッティング、ボルテックス、高速回転を避けることが重要です。最適な固定は、3D組織構造を維持し、内因性蛍光を維持するために重要です。H2BeGFPシグナルを保持するには30分の固定で十分であり、このプロトコルで使用される抗体に最適ですが、これは使用する蛍光色素と抗体によって異なる場合があります。オルガノイドをクリアすると、光の散乱が減少し、3D構造全体の視覚化が大幅に向上します。オルガノイドが小さいため、クリアリングは簡単かつ迅速です。ただし、レーザー走査型共焦点顕微鏡を使用してオルガノイド全体をイメージングするには、複数のZスタックを作成する必要があるため、時間がかかる場合があります。スピニングディスクのような共焦点顕微鏡は、イメージング時間を短縮するために使用できます。
全体として、線維芽細胞の存在下で増殖した食道オルガノイドは、食道幹細胞ニッチの側面を理解するための貴重なツールを提供します。さらに、ホールマウントクリアリングは、線維芽細胞とオルガノイド間の相互作用を視覚化するためのアクセス可能な方法を提供します。
The authors have nothing to disclose.
この研究はERC StG TroyCAN(851241)によってサポートされました。E.E.はCancerfondenのポスドクアソシエイトです。M.G.はラグナル・ソデルバーグ・フェローであり、キャンサーフォンデンのジュニア研究者です。バイオメディカムフローサイトメトリーコア施設、バイオメディカムイメージングコア(BIC)、比較医学バイオメディカム(KMB)動物施設など、カロリンスカ研究所のコア施設からの技術支援に感謝しています。プロトコルを注意深く読み、コメントしてくれたGenanderラボのメンバーに感謝します。
B-27 Supplement (50X), serum free | Thermo Fisher (Gibco) | 17504001 | |
Corning Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix | fisher scientific | 356231 | |
Dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | 276855-100ML | |
DMEM/F-12 | Thermo Fisher (Gibco) | 11320074 | |
DPBS | Thermo Fisher (Gibco) | 14190250 | |
Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | F7524 | |
GlutaMAX Supplement | Thermo Fisher (Gibco) | 35050061 | |
HBSS, no calcium, no magnesium, no phenol red | Thermo Fisher (Gibco) | 14175-129 | |
Normal Donkey Serum | Jackson Immuno | 017-000-121 | |
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Thermo Fisher (Gibco) | 15140122 | |
Triton X-100 solution | Merck | 93443-100ML | |
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | Thermo Fisher (Gibco) | 25200-056 | |
Chemicals, Peptides, and recombinant proteins | |||
DAPI Solution | Thermo Fisher | 62248 | |
Dissociation solution: 0.25 mg/ml Liberase TM, 0.25 mg/ml Dnase in HBSS | |||
Dnase I | Sigma-Aldrich | 11284932001 | |
Formaldehyde, 37%, with 10-15% methanol | Sigma-Aldrich | 252549-1L | |
Liberase | Sigma-Aldrich | 5401127001 | |
N-Acetyl-cysteine | Sigma-Aldrich | A9165-25G | |
Noggin murine | Peprotech | 250-38 | |
RapiClear 1.47 | SunJin Lab | #RC147001 | |
Recombinant Mouse EGF Protein, CF | R&D systems | 2028-EG-200 | |
R-spondin-1 murine | Peprotech | 315-32 | |
SYTOX Blue Dead Cell Stain | Thermo Fisher | S34857 | |
Thermolysin | Sigma-Aldrich | T7902-25MG | |
Y-27632 dihydrochloride | Sigma-Aldrich | Y0503-5MG | |
Plastic & Glassware | |||
Corning Sterile Cell Strainers 40um | VWR | 15360801 | |
Corning Sterile Cell Strainers 70um | VWR | 431751 | |
Menzel Deckgläser/ cover slips | Thermo Fisher | Q10143263NR15 | |
SafeSeal reaction tube, 1.5 mL, PP | Sarstedt | 72.706 | |
Snap Cap Low Retention Microcentrifuge Tubes 0.6 mL | Thermo Fisher | 3446 | |
SuperFrost Slides | VWR | 631-9483 | |
Tools | |||
0.05 mm 4 circular well iSpacer | SunJin Lab | #IS204 | |
Dumont #5 forceps, biology tip | F.S.T | 11252-20 | |
ImmEdge Pen | VectorLaboratories | H-4000 | |
Spring Scissors Angled to Side Ball Tip 8mm Cutting Edge | F.S.T | 15033-09 | |
Instruments | |||
Confocal microscope Stellaris 5 | Leica | ||
Dissection microscope ZEISS Stemi 305 | Zeiss | ||
FACS ARIA III | BD Biosciences | ||
Conjugated Antibodies for FACS | |||
Alexa Fluor 647 anti-mouse CD104 Antibody Clone: 346-11A |
123608 | 123608 | |
APC anti-mouse CD26 (DPP-4) Antibody | H194-112 | H194-112 | |
PE/Cy7 anti-mouse/human CD324 (E-Cadherin) Antibody | 147310 | 147310 | |
Antibodies for Immunofluorescence | |||
CD104 (ß-integrin 4) Clone: 346-11A |
BioLegend | 553745 | |
Cytokeratin 14 | Acris Antibodies (AbD Serotec) | BP5009 | |
Cytokeratin13 Clone: EPR3671 |
abcam | ab92551 | |
E-cadherin (CD324) Clone: 2.40E+11 |
Cell Signaling Technology | 3195 | |
Keratin 5 Polyclonal Chicken Antibody, Purified Clone: Poly9059 |
BioLegend | 905901 | |
p63 Clone: 4a4 |
abcam | ab735 | |
Recombinant Anti-KLF4 antibod Clone: EPR20753-25 |
abcam | ab214666 | |
Vimentin | Sigma-Aldrich | AB5733 | |
Secondary antibodies | |||
Donkey anti-species* antibodies with fluorophore of choice | Jackson Immuno |