التوصيف الوظيفي والتصور للخلايا الليفية المريئية باستخدام الثقافات العضوية المشتركة
Summary
توفر الثقافات المشتركة للخلايا الليفية العضوية نموذجا لدراسة مكانة الخلايا الجذعية في الجسم الحي . هنا ، يتم وصف بروتوكول للثقافات المشتركة للخلايا الليفية العضوية المريئية. بالإضافة إلى ذلك ، يتم استخدام تصوير جبل كامل لتصور التفاعل بين الخلايا الليفية والعضوية.
Abstract
تساهم الخلايا الجذعية الظهارية والسلفية في تكوين وصيانة الحاجز الظهاري طوال الحياة. يتم وضع معظم مجموعات الخلايا الجذعية والسلفية بعيدا في مواقع متميزة تشريحيا ، مما يتيح تفاعلات حصرية مع الإشارات المتخصصة التي تحافظ على الجذعية. في حين أن تطوير الثقافات العضوية الظهارية يوفر أداة قوية لفهم دور الخلايا الجذعية والسلفية في التوازن والمرض ، فإن التفاعل داخل البيئة المتخصصة غائب إلى حد كبير ، مما يعيق تحديد العوامل التي تؤثر على سلوك الخلايا الجذعية. تلعب الخلايا الليفية دورا رئيسيا في توجيه مصير الجذع الظهاري والسلف. هنا ، يتم تقديم بروتوكول شامل للاستزراع المشترك للخلايا العضوية الليفية يتيح تحديد المجموعات الفرعية للخلايا الليفية في تجديد الخلايا السلفية المريئية وتمايزها. في هذا البروتوكول ، يتم وصف طريقة لعزل كل من الخلايا الظهارية والخلايا الليفية بالتوازي مع المريء. تم تحديد استراتيجيات فرز الخلايا المنشطة بالفلورة المتميزة لعزل كل من الخلايا السلفية المريئية وكذلك المجموعات الفرعية للخلايا الليفية من المراسل المعدل وراثيا أو الفئران البرية. يوفر هذا البروتوكول نهجا متعدد الاستخدامات يمكن تكييفه لاستيعاب عزل مجموعات فرعية محددة من الخلايا الليفية. يتم تضمين إنشاء وتمرير الثقافات العضوية الظهارية المريئية في هذا البروتوكول ، مما يتيح مقارنة مباشرة مع نظام الاستزراع المشترك. بالإضافة إلى ذلك ، يتم وصف نهج المقاصة 3D السماح لتحليل الصورة التفصيلية للتفاعلات الظهارية الليفية. بشكل جماعي ، يصف هذا البروتوكول طريقة مقارنة وعالية الإنتاجية نسبيا لتحديد وفهم مكونات الخلايا الجذعية المريئية المتخصصة في المختبر.
Introduction
تستخدم المواد العضوية كمقايسات ثلاثية الأبعاد في المختبر لتوصيف الخلايا الجذعية والسلفية ، وكذلك لفهم إشارات الإشارات المشتقة من المكونات الخلوية لمكانة الخلايا الجذعية1،2،3،4. تم وصف عضويات المريء للفأر لأول مرة في عام 2014 وحددت العديد من الأوراق عوامل النمو ، مثل R-Spondin (RSPO) و NOGGIN وعامل نمو البشرة (EGF) ، اللازمة للحفاظ على عضويات المريء ومرورها5،6،7 ، بحجة أن إشارات إشارات مماثلة مطلوبة في الجسم الحي تجديد الخلايا السلفية. ومع ذلك ، يتم إضافة عوامل النمو بشكل شائع في التركيزات غير الفسيولوجية ، مما يؤدي إلى ظروف نمو عضوية لا تعكس بالضرورة بيئة الإشارات في الجسم الحي.
الخلايا الليفية هي مجموعات خلايا انسجة غير متجانسة تدعم خصائص الخلايا السلفية في العديد من منافذ الخلايا الجذعية8. إن الجمع بين الخلايا السلفية الظهارية والخلايا الليفية في نفس الثقافة العضوية يمكن من تكوين عضوي بتركيزات منخفضة من عوامل النمو المكملة خارجيا. تم وصف أنظمة الاستزراع المشترك العضوي من الظهارة المعوية والكبدية ، ولكن بروتوكول إنشاء مزارع مشتركة للخلايا الليفية العضوية المريئية لا يزال معلقا9،10،11.
في هذا البروتوكول ، تم تحديد استراتيجيتين لفرز الخلايا المنشطة بالفلورة (FACS) للخلايا الليفية من المريء ، باستخدام إما الفئران المعدلة وراثيا PdgfrαH2BeGFP 12 أو الفئران من النوع البري مع تلطيخ الأجسام المضادة الكلاسيكية. يمكن عزل مجموعات فرعية مختلفة من الخلايا الليفية باستخدام علامات سطح الخلية المفضلة ، وبالتالي توفير المرونة للبروتوكول. بالإضافة إلى ذلك ، يتم استخدام تقنية التصوير الفلوري 3D الحفاظ على مورفولوجيا العضوية لتوصيف تفاعلات الخلايا الليفية العضوية. يوفر التطهير العضوي طريقة سريعة لزيادة عمق تغلغل الضوء في المواد العضوية ، وتحسين تصور وصلات الخلايا الليفية العضوية وتمكين تلخيص البنية العضوية بالكامل. يجمع هذا البروتوكول بين الثقافة العضوية المريئية المشتركة واستراتيجية تصوير التركيب الكاملة ، مما يتيح التوصيف الوظيفي للتفاعل بين الخلايا الليفية والعضوية.
Protocol
Representative Results
Discussion
ينشئ البروتوكول المقدم هنا نموذجا في المختبر للتحقيق في تفاعلات الخلايا الليفية الظهارية المريئية الوظيفية.
يتم فصل الطبقة الظهارية عن السدى ، مما يسمح ببروتوكول تفكك محسن لكل من المقصورة الظهارية واللحمية. على الرغم من تحسين بروتوكول التفكك الظهاري ، تظل كتل الأنسجة واضحة. يؤدي الشفط لأعلى ولأسفل بقوة كل 15 دقيقة إلى تقليل عدد وحجم الكتل بشكل كبير. تستخدم البروتوكولات الأخرى التربسين لزيادة فصل الطبقة الظهارية 5,6. هنا ، لا ينصح باستخدام التربسين ، أو زيادة وقت التفكك ، لأن هذا يميل إلى انخفاض صلاحية الخلايا الظهارية وكفاءة تشكيل العضوية. على عكس الظهارة ، يتم فصل السدى بسهولة ، وينتج عن 30 دقيقة في محلول التفكك تعليق أحادي الخلية مع ~ 90٪ من صلاحية الخلايا الليفية (الشكل 1E). يؤدي استبعاد خطوة الفصل الظهاري الفموي في البروتوكول إلى زيادة وقت التفكك بشكل كبير ، مما يؤدي إلى انخفاض صلاحية الخلايا الليفية وانخفاض إنتاجية الخلايا الظهارية. بالإضافة إلى ذلك ، يوفر فصل الظهارة عن السدى فرصة لتحديد أعداد الخلايا لكل مجموعة وخلط الخلايا الظهارية والخلايا الليفية من خطوط الفئران المختلفة عند إعداد الثقافات المشتركة.
دراسة وظيفة الخلايا الليفية على نمو الأعضاء هي طريقة شائعة الاستخدام في بيولوجيا الخلايا الجذعية 9،10،11،15،16. وسائط الاستزراع المشترك الراسخة إما DMEM مكملة بمصل عجل الجنين بنسبة 10٪ (FCS) 9,15 أو عامل نمو متوسطمنخفض 10,16. في هذا البروتوكول ، يتم استخدام الوسط المختزل لعامل النمو لتقليد الظروف في مكانة الخلايا الجذعية في الجسم الحي ، حيث تكون الخلايا الليفية هادئة إلى حد كبير. FCS هو مصل غني بعامل النمو يؤدي إلى تنشيط وتكاثر الخلايا الليفية في الثقافات المشتركة ، ومن المحتمل أن يتوافق مع حالة خلية ليفية متميزة عن الحالة في الجسم الحي. من خلال استبعاد FCS وتقليل عوامل النمو ، بحيث لا يدعم الوسط وحده (ER low) نمو الأعضاء ولا يحفز تكاثر الخلايا الليفية ، فمن الممكن عزل تأثير الخلايا الليفية على نمو العضوي. في هذه الوسيلة ، تتم إزالة NOGGIN وتقليل RSPO إلى الحد الأدنى (10٪ RPSO). وقد ثبت أن كلا من NOGGIN و RSPO ضروريان لنمو المريءالعضوي 6. تم الاحتفاظ ب EGF في وسط الاستزراع المشترك ، لأنه لا يدعم النمو العضوي في حد ذاته. ومع ذلك ، فإن الخلايا الليفية قادرة أيضا على دعم نمو الأعضاء في وسط منخفض EGF (E lowRlow; الشكل 2 ب ، د).
لا يمكن الحفاظ على الثقافات العضوية المشتركة من خلال المرور حيث يتم فقدان الخلايا الليفية أثناء التربسين. ومع ذلك ، تم تضمين تمرير العضوي في البروتوكول حيث يمكن الحفاظ على عضويات المريء وتوسيعها واستخدامها لمزيد من التجارب كمزارع أحادية. يمكن استخدام المواد العضوية المارة من الثقافات الأحادية لإنشاء مزارع مشتركة مع الخلايا الليفية المعزولة حديثا. عيب استخدام الخلايا الأولية هو عدد الفئران اللازمة لإنشاء ثقافات عضوية مشتركة متعددة. عند التركيز على مجموعات فرعية صغيرة من الخلايا الليفية ، يكون عدد الثقافات المشتركة التي تم الحصول عليها محدودا. في بروتوكولات أخرى ، يتم توسيع الخلايا الليفية أولا في الثقافة قبل استخدامها لإعداد مزارع عضويةمشتركة 10. ومع ذلك ، فإن الخلايا الليفية تغير التشكل والهوية أثناء المرور ، كما هو موضح باستخدام الجلد الأساسي والخلايا الليفية القلبية17,18. يؤدي تمرير 2D التقليدي للخلايا الليفية المريئية إلى كل من التشكل والتغيرات الظاهرية ، مما يدل على أن إثراء الخلايا الليفية في المختبر غير مناسب للثقافات المشتركة التي تهدف إلى التكاثر الظاهري لمكانة الخلايا الجذعية الذاتية.
يوفر تلطيخ جبل كامل أداة للحفاظ على وتصور التفاعل بين الخلايا الليفية والعضوية. تجدر الإشارة إلى أنه على الرغم من أنه لن تحتوي جميع الكائنات العضوية على خلايا ليفية مرتبطة بها مباشرة ، فإن معظم الكائنات العضوية على اتصال بالخلايا الليفية (انظر الشكل 2C). للحفاظ على تفاعلات الخلايا الليفية الظهارية ، من المهم التعامل مع المواد العضوية بعناية وتجنب السحب القوي ، والدوامة ، والغزل عالي السرعة. التثبيت الأمثل مهم للحفاظ على بنية الأنسجة 3D ، وكذلك الحفاظ على مضان الذاتية. يكفي التثبيت لمدة 30 دقيقة للاحتفاظ بإشارة H2BeGFP وهو مثالي للأجسام المضادة المستخدمة في هذا البروتوكول ، ولكن هذا قد يختلف بين الفلوروفورات والأجسام المضادة المستخدمة. إزالة المواد العضوية يقلل من تشتت الضوء ويحسن التصور لهيكل 3D بأكمله بشكل كبير. نظرا لأن المواد العضوية صغيرة ، فإن المقاصة سهلة وسريعة. ومع ذلك ، فإن تصوير الكائنات العضوية الكاملة باستخدام الفحص المجهري متحد البؤر للمسح بالليزر يمكن أن يستغرق وقتا طويلا ، حيث يجب عمل العديد من مداخن Z. يمكن استخدام المجاهر متحدة البؤر ، مثل القرص الدوار ، لتقليل وقت التصوير.
بشكل عام ، توفر عضويات المريء التي تزرع في وجود الخلايا الليفية أداة قيمة لفهم جوانب مكانة الخلايا الجذعية المريئية. بالإضافة إلى ذلك ، يوفر تطهير التثبيت الكامل طريقة يمكن الوصول إليها لتصور التفاعل بين الخلايا الليفية والمواد العضوية.
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم دعم هذه الدراسة من قبل ERC StG TroyCAN (851241). E.E. هو زميل ما بعد الدكتوراه في Cancerfonden. م. ج. هو زميل راجنار سودربيرغ وباحث مبتدئ في Cancerfonden. نحن ممتنون للمساعدة الفنية من المرافق الأساسية لمعهد كارولينسكا ، بما في ذلك المرفق الأساسي لقياس التدفق الخلوي للطب الحيوي ، و Biomedicum Imaging Core (BIC) ، ومرفق الطب الحيوي المقارن (KMB) الحيواني. نشكر أعضاء مختبر Genander على قراءة البروتوكول والتعليق عليه بعناية.
Materials
| B-27 Supplement (50X), serum free | Thermo Fisher (Gibco) | 17504001 | |
| Corning Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix | fisher scientific | 356231 | |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | 276855-100ML | |
| DMEM/F-12 | Thermo Fisher (Gibco) | 11320074 | |
| DPBS | Thermo Fisher (Gibco) | 14190250 | |
| Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | F7524 | |
| GlutaMAX Supplement | Thermo Fisher (Gibco) | 35050061 | |
| HBSS, no calcium, no magnesium, no phenol red | Thermo Fisher (Gibco) | 14175-129 | |
| Normal Donkey Serum | Jackson Immuno | 017-000-121 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Thermo Fisher (Gibco) | 15140122 | |
| Triton X-100 solution | Merck | 93443-100ML | |
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | Thermo Fisher (Gibco) | 25200-056 | |
| Chemicals, Peptides, and recombinant proteins | |||
| DAPI Solution | Thermo Fisher | 62248 | |
| Dissociation solution: 0.25 mg/ml Liberase TM, 0.25 mg/ml Dnase in HBSS | |||
| Dnase I | Sigma-Aldrich | 11284932001 | |
| Formaldehyde, 37%, with 10-15% methanol | Sigma-Aldrich | 252549-1L | |
| Liberase | Sigma-Aldrich | 5401127001 | |
| N-Acetyl-cysteine | Sigma-Aldrich | A9165-25G | |
| Noggin murine | Peprotech | 250-38 | |
| RapiClear 1.47 | SunJin Lab | #RC147001 | |
| Recombinant Mouse EGF Protein, CF | R&D systems | 2028-EG-200 | |
| R-spondin-1 murine | Peprotech | 315-32 | |
| SYTOX Blue Dead Cell Stain | Thermo Fisher | S34857 | |
| Thermolysin | Sigma-Aldrich | T7902-25MG | |
| Y-27632 dihydrochloride | Sigma-Aldrich | Y0503-5MG | |
| Plastic & Glassware | |||
| Corning Sterile Cell Strainers 40um | VWR | 15360801 | |
| Corning Sterile Cell Strainers 70um | VWR | 431751 | |
| Menzel Deckgläser/ cover slips | Thermo Fisher | Q10143263NR15 | |
| SafeSeal reaction tube, 1.5 mL, PP | Sarstedt | 72.706 | |
| Snap Cap Low Retention Microcentrifuge Tubes 0.6 mL | Thermo Fisher | 3446 | |
| SuperFrost Slides | VWR | 631-9483 | |
| Tools | |||
| 0.05 mm 4 circular well iSpacer | SunJin Lab | #IS204 | |
| Dumont #5 forceps, biology tip | F.S.T | 11252-20 | |
| ImmEdge Pen | VectorLaboratories | H-4000 | |
| Spring Scissors Angled to Side Ball Tip 8mm Cutting Edge | F.S.T | 15033-09 | |
| Instruments | |||
| Confocal microscope Stellaris 5 | Leica | ||
| Dissection microscope ZEISS Stemi 305 | Zeiss | ||
| FACS ARIA III | BD Biosciences | ||
| Conjugated Antibodies for FACS | |||
| Alexa Fluor 647 anti-mouse CD104 Antibody Clone: 346-11A |
123608 | 123608 | |
| APC anti-mouse CD26 (DPP-4) Antibody | H194-112 | H194-112 | |
| PE/Cy7 anti-mouse/human CD324 (E-Cadherin) Antibody | 147310 | 147310 | |
| Antibodies for Immunofluorescence | |||
| CD104 (ß-integrin 4) Clone: 346-11A |
BioLegend | 553745 | |
| Cytokeratin 14 | Acris Antibodies (AbD Serotec) | BP5009 | |
| Cytokeratin13 Clone: EPR3671 |
abcam | ab92551 | |
| E-cadherin (CD324) Clone: 2.40E+11 |
Cell Signaling Technology | 3195 | |
| Keratin 5 Polyclonal Chicken Antibody, Purified Clone: Poly9059 |
BioLegend | 905901 | |
| p63 Clone: 4a4 |
abcam | ab735 | |
| Recombinant Anti-KLF4 antibod Clone: EPR20753-25 |
abcam | ab214666 | |
| Vimentin | Sigma-Aldrich | AB5733 | |
| Secondary antibodies | |||
| Donkey anti-species* antibodies with fluorophore of choice | Jackson Immuno |
Riferimenti
- Sachs, N., et al. Long-term expanding human airway organoids for disease modeling. The EMBO Journal. 38 (4), 100300 (2019).
- Lohmussaar, K., et al. Patient-derived organoids model cervical tissue dynamics and viral oncogenesis in cervical cancer. Cell Stem Cell. 28 (8), 1380-1396 (2021).
- Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
- Smukler, S. R., et al. The adult mouse and human pancreas contain rare multipotent stem cells that express insulin. Cell Stem Cell. 8 (3), 281-293 (2011).
- Zheng, B., et al. A new murine esophageal organoid culture method and organoid-based model of esophageal squamous cell neoplasia. iScience. 24 (12), 103440 (2021).
- DeWard, A. D., Cramer, J., Lagasse, E. Cellular heterogeneity in the mouse esophagus implicates the presence of a nonquiescent epithelial stem cell population. Cell Reports. 9 (2), 701-711 (2014).
- Kasagi, Y., et al. The esophageal organoid system reveals functional interplay between notch and cytokines in reactive epithelial changes. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 5 (3), 333-352 (2018).
- Plikus, M. V., et al. Fibroblasts: Origins, definitions, and functions in health and disease. Cell. 184 (15), 3852-3872 (2021).
- McCarthy, N., et al. Distinct mesenchymal cell populations generate the essential intestinal BMP signaling gradient. Cell Stem Cell. 26 (3), 391-402 (2020).
- Cordero-Espinoza, L., et al. Dynamic cell contacts between periportal mesenchyme and ductal epithelium act as a rheostat for liver cell proliferation. Cell Stem Cell. 28 (11), 1907-1921 (2021).
- Pastula, A., et al. Three-dimensional gastrointestinal organoid culture in combination with nerves or fibroblasts: a method to characterize the gastrointestinal stem cell niche. Stem Cells International. 2016, 3710836 (2016).
- Hamilton, T. G., Klinghoffer, R. A., Corrin, P. D., Soriano, P. Evolutionary divergence of platelet-derived growth factor alpha receptor signaling mechanisms. Molecular and Cellular Biology. 23 (11), 4013-4025 (2003).
- McGinn, J., et al. A biomechanical switch regulates the transition towards homeostasis in oesophageal epithelium. Nature Cell Biology. 23 (5), 511-525 (2021).
- Zhang, Y., Bailey, D., Yang, P., Kim, E., Que, J. The development and stem cells of the esophagus. Development. 148 (6), (2021).
- Ohlund, D., et al. Distinct populations of inflammatory fibroblasts and myofibroblasts in pancreatic cancer. The Journal of Experimental Medicine. 214 (3), 579-596 (2017).
- Pentinmikko, N., et al. Notum produced by Paneth cells attenuates regeneration of aged intestinal epithelium. Nature. 571 (7765), 398-402 (2019).
- Janson, D., Rietveld, M., Willemze, R., El Ghalbzouri, A. Effects of serially passaged fibroblasts on dermal and epidermal morphogenesis in human skin equivalents. Biogerontology. 14 (2), 131-140 (2013).
- Landry, N. M., Rattan, S. G., Dixon, I. M. C. An improved method of maintaining primary murine cardiac fibroblasts in two-dimensional cell culture. Scientific Reports. 9 (1), 12889 (2019).
