Caracterização funcional e visualização de fibroblastos esofágicos utilizando co-culturas organoides

As experiências em animais para este estudo foram aprovadas pela Stockholms Norra djurförsöksetiska nämnd (licença ética n.º 14051-2019). Os animais foram alojados em condições livres de patógenos de acordo com as recomendações da Federation of European Laboratory Animal Science Association. 1. Preparo Descongelar as soluções-mãe enzimáticas utilizadas para dissociação (ver Tabela de Materiais) no gelo. Descongelar uma alíquota da matriz da membrana basal (matriz) reduzida do fator de crescimento (TFG) a 4 °C. Prepare o meio de cultura. Utilizar o meio descrito na Tabela 1 para culturas e coculturas organoides e prepará-lo antes de iniciar o protocolo. 2. Dissecção e separação do epitélio esofágico e estroma NOTA: Certifique-se de que todos os instrumentos usados para dissecção e processamento de tecidos sejam estéreis. Preparar 2 ml de solução de dissociação (ver Tabela de Materiais) em solução salina balanceada de Hanks (HBSS) por três esófagos. Use uma cepa de mouse de escolha, como camundongos C57BL/6J. O desenvolvimento esofágico em camundongos termina após o dia pós-natal (p) 70, por isso recomenda-se o uso de camundongos com idade mais velha que p7013. Use quatro ou cinco camundongos, pois eles fornecem material suficiente para estabelecer 8-10 co-culturas de organoides.NOTA: A eficiência de formação de organoides diminui com a idade dos camundongos. Se subpopulações específicas de fibroblastos forem de interesse, é possível que o baixo rendimento de fibroblastos esteja limitando o número de co-culturas organoides que podem ser estabelecidas. Use camundongos geneticamente modificados (por exemplo, PdgfrαH2BeGFP) ou selvagens (WT) para o isolamento de populações de fibroblastos. Ao usar camundongos WT, realize a coloração de anticorpos para isolar subpopulações específicas de fibroblastos do estroma via FACS. Eutanásia dos camundongos por asfixia por CO2 . Dissecar o esôfago com pinça e tesoura de dissecção. Para remover todo o esôfago, corte a extremidade distal do esôfago diretamente acima do estômago e a extremidade proximal no início da traqueia. Submergir o esôfago em PBS e colocá-lo no gelo. Remover mecanicamente a muscular externa usando um microscópio de dissecção (amplitude total de 8x-40x) e pinças. Segurar a extremidade distal do esôfago dissecado com uma pinça e usar a outra pinça para agarrar e puxar o músculo da extremidade distal para a proximal do esôfago dissecado. Retire e descarte a camada muscular. Abra o esôfago longitudinalmente. Isso funciona melhor usando tesoura de mola de microdissecção com uma ponta de esfera para evitar danos ao tecido. Segure uma extremidade do esôfago para inserir a bola da tesoura de mola no lúmen do esôfago e abra o esôfago enquanto segura até a extremidade. Coloque o esôfago em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL ou em uma placa de 24 poços. Incubar o esôfago aberto em 0,5 mg/mL de termolisina em HBSS a 37 °C em um balancim por 15 min. Submergir completamente o esôfago em solução de termolisina.NOTA: O volume de solução de termolisina utilizado depende do tamanho do poço ou do tubo. Vários esôfagos podem ser colocados e submersos no mesmo poço ou tubo. Retire o esôfago da solução de termolisina. Use um microscópio de dissecção para separar cuidadosamente o epitélio esofágico do estroma. Usando pinças finas, pegue o lado epitelial e o lado do estroma do tecido e lentamente os afaste para separar as duas camadas.NOTA: O estroma é identificado por sua aparência branca e opaca, em contraste com o epitélio transparente. O estroma contém a lâmina própria e a camada submucosa. Transferir a camada epitelial e estromal para dois tubos de microcentrífuga separados de 1,5 mL com 200 μL de solução de dissociação em HBSS. Coloque no gelo. 3. Isolamento de células progenitoras esofágicas OBS: O isolamento das células progenitoras esofágicas (etapa 2) e fibroblastos (etapa 3) pode ser realizado simultaneamente. Preparar um tubo de 50 mL de FBS a 1% em HBSS (FBS a 1%). Transferir o epitélio esofágico separado do tubo de microcentrífuga de 1,5 ml (passo 2.8) para uma placa de Petri limpa e utilizar um bisturi afiado para picar. Recolher o tecido picado da placa de Petri com 200 μL de solução de dissociação e transferi-lo de volta para o tubo de microcentrífuga de 1,5 ml.NOTA: O epitélio é picado corretamente quando as peças podem ser colocadas de volta no tubo de microcentrífuga de 1,5 mL usando uma ponta de pipeta de 200 μL. Adicionar 800 μL de solução de dissociação fresca ao tubo de microcentrífuga de 1,5 mL para um volume total de 1 mL.NOTA: É importante adicionar um volume suficiente de solução de dissociação. Por um a três esôfagos, recomenda-se 1 mL de solução. Aumente a escala quando mais esôfago for processado de uma só vez. Colocar o tubo com a camada epitelial picada num balancim a 37 °C durante 60 minutos. Pipetar a solução para cima e para baixo aproximadamente 20 vezes usando uma ponta de pipeta de 200 μL a cada 15 min para melhorar a digestão. Após 60 min, pipetar para cima e para baixo mais 20 vezes usando uma ponteira de pipeta de 200 μL. Passar a solução através de um filtro celular de 40 μm para um novo tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Centrifugar a 300 x g durante 10 min a 4 °C.NOTA: Molhe o filtro celular com 1% de FBS antes de forçar as células para minimizar a aderência das células ao filtro. O epitélio não será completamente digerido, e pedaços de tecido ainda serão visíveis. A incubação mais longa, no entanto, diminuirá a sobrevivência celular e não resultará em maior rendimento de células viáveis. Descarte o sobrenadante removendo o excesso de líquido com uma pipeta de 1 mL e ressuspenda o pellet em 1 mL de FBS a 1%. Centrifugar a 300 x g durante 10 min a 4 °C.Durante a centrifugação, preparar a mistura de anticorpos conjugados para FACS de células progenitoras esofágicas. Misturar 1 μL de CD324-PE-Cy7 (ECADHERIN) e CD104-A647 (INTEGRIN-β4) em 200 μL de FBS a 1% por milhão de células.NOTA: 1 μL de anticorpo (200 μL de volume final) é suficiente para um ou dois esôfagos. Ao processar mais esôfago de uma só vez, aumente o volume da solução de coloração de anticorpos. Ressuspender o pellet em 200 μL de mistura de anticorpos e transferir para um tubo de citometria de fluxo. Depois de adicionar anticorpos fluorescentes, mantenha as suspensões celulares no escuro para evitar o clareamento do sinal. Incubar as células durante 30 min a 4 °C. Adicionar 3 mL de SFB a 1% e centrifugar a 300 x g por 10 min a 4 °C e, em seguida, ressuspender as células em um mínimo de 200 μL de 1% de SFB.NOTA: 500 μL de SFB a 1% é usado para até quatro ou cinco esôfagos. Aumente o volume quando mais esôfago for processado de uma só vez, para que uma taxa de fluxo FACS de 100-300 eventos/s possa ser alcançada. Mais eventos/s diminuirão a eficiência de classificação, e um aumento na taxa de fluxo diminuirá a sobrevivência celular. Adicionar marcador de coloração de células mortas a uma concentração final de 1:10.000, 5 minutos antes da classificação FACS para isolar células vivas. Classifique as células progenitoras usando uma máquina FACS (consulte a Figura 1 para estratégia de limitação). Coletar as células em tubos de microcentrífuga de 1,5 mL preenchidos com 200 μL de meio organoide básico (Tabela 1). 4. Isolamento de fibroblastos da camada estromal Cortar a camada estomal em pedaços finos num tubo de 1,5 ml contendo 200 μL de solução de dissociação (passo 2.8) utilizando tesoura de dissecção. O tecido é devidamente picado, uma vez que a solução pode ser pipetada para cima e para baixo usando uma ponta de pipeta de 200 μL. Adicionar 800 μL de solução de dissociação fresca ao tubo de microcentrífuga de 1,5 mL para um volume total de 1 mL.NOTA: É importante adicionar um volume suficiente de solução de dissociação. Por um a três esôfagos, recomenda-se 1 mL de solução. Aumente a escala quando mais esôfago for processado de uma só vez. Colocar o tubo num balancim a 37 °C durante 30 minutos. Após 15 min, pipetar a solução para cima e para baixo aproximadamente 20 vezes usando uma ponta de pipeta de 200 μL para melhorar a digestão. Após 30 min de digestão enzimática, pipetar para cima e para baixo mais 20 vezes usando uma ponteira de pipeta de 200 μL. Coar a solução através de um filtro de células de 70 μm em um novo tubo de microcentrífuga de 1,5 mL. Centrifugar a 300 x g durante 10 min a 4 °C.NOTA: Molhe o filtro celular com 1% de FBS antes de forçar as células para minimizar a aderência das células ao filtro. Descarte o sobrenadante removendo o excesso de líquido com uma pipeta de 1 mL e ressuspenda o pellet em 1 mL de FBS a 1%. Centrifugar a 300 x g durante 10 min a 4 °C.NOTA: Ao usar uma cepa de camundongo geneticamente modificada contendo fibroblastos marcados com farinescência, as colorações de anticorpos são opcionais. Se não forem necessárias colorações de anticorpos, continue com a etapa 3.7 e transfira a amostra para um tubo de citometria de fluxo.Durante a centrifugação, preparar a mistura de anticorpos conjugados para o isolamento FACS de fibroblastos. Misturar 1 μL de CD26-APC (DPP4) em 200 μL de FBS a 1% por milhão de células.NOTA: 1 μL de anticorpo é suficiente para um ou dois esôfagos. Ao processar mais esôfago de uma só vez, aumente o volume da solução de coloração de anticorpos. Ressuspender o pellet em 200 μL de mistura de anticorpos conjugados em FBS a 1% e transferir para um tubo de citometria de fluxo. Incubar as células durante 30 min a 4 °C. Adicionar 3 ml de SFB a 1% e centrifugar a 300 x g durante 10 minutos a 4 °C. Ressuspender as células em um mínimo de 200 μL de 1% de SFB.NOTA: 500 μL de SFB a 1% é usado para até quatro ou cinco esôfagos. Aumente o volume quando mais esôfago for processado de uma só vez, para que uma taxa de fluxo de 100-300 eventos/s possa ser alcançada. Mais eventos/s diminuirão a eficiência de classificação, e o aumento da taxa de fluxo diminuirá a sobrevivência celular. Após a adição de anticorpos fluorescentes, as suspensões celulares devem ser mantidas escuras para evitar o clareamento do sinal. Adicionar marcador de coloração de células mortas a uma concentração final de 1:10.000, 5 minutos antes da classificação FACS para isolar células vivas. Classifique as células usando uma máquina FACS (consulte a Figura 1 para obter a estratégia de limitação). Coletar as células em tubos de microcentrífuga de 1,5 mL preenchidos com 200 μL de meio organoide básico (Tabela 1). 5. Estabelecimento e cultura de organoides esofágicos NOTA: Pré-aquecer REbaixo (co-cultura organoide), meio ENR (organoide) (ver Tabela 1 para descrição) e uma placa de 48 poços a 37 °C. Coloque a alíquota da matriz descongelada (preparada no passo 1) sobre o gelo. Recomenda-se o uso da matriz fornecida aqui (ver Tabela de Materiais) para cultura de organoides esofágicos de camundongos, uma vez que outras marcas de matriz afetam negativamente a eficiência de formação de organoides. Para a co-cultura de organoides, misturar as células epiteliais e fibroblastos selecionados na proporção de 1:2 em um tubo. Para cada cúpula matricial, utilizar 5.000 células epiteliais e 10.000 fibroblastos. Ao se preparar para mais cúpulas, adicione um múltiplo de 5.000 células epiteliais e 10.000 fibroblastos a um tubo. Para culturas de organoides sem fibroblastos, utilizar 5.000 células epiteliais por cúpula da matriz. Centrifugar a população de células mistas a 300 x g por 5 min. Descarte o sobrenadante removendo-o cuidadosamente com uma pipeta de 200 μL. Lave as células uma vez, ressuspendendo o pellet em meio organoide básico frio e centrifugando a 300 x g por 5 min. Coloque as células no gelo. Prepare uma mistura composta por 80% de matriz e 20% de meio organoide básico frio. Coloque tudo no gelo enquanto a matriz se solidifica à temperatura ambiente (TR). Eliminar o sobrenadante após a centrifugação, retirando-o cuidadosamente com uma pipeta de 200 μL. Ressuspender as células em 10 μL de matriz mistura/cúpula e colocar novamente no gelo. Pegue a placa pré-aquecida de 48 poços da incubadora de 37 °C e faça uma cúpula matricial por poço usando uma pipeta de 20 μL. Cada cúpula contém 10 μL de matriz de 80%, 5.000 células epiteliais,s e 10.000 fibroblastos. Transfira a placa de cabeça para baixo para uma incubadora e deixe as cúpulas solidificarem por mais 20-30 min a 37 °C.NOTA: Uma diminuição no volume da cúpula da matriz e/ou um aumento no número de células afetará a eficiência de formação do organoide. Adicionar 200 μL de meio baixo de RE pré-aquecido (Tabela 1) às cúpulas matriciais contendo coculturas organoidese meio ENR (Tabela 1) às respectivas cúpulas matriciais contendo apenas organoides epiteliais e colocar a placa na incubadora. Cultivar os organoides a 37 °C e 5% CO2. Nos primeiros 2 dias, suplementar o meio com 10 μM de inibidor de rocha (Y-27623). O inibidor de rocha previne a morte celular induzida por estresse e aumenta a chance de um estabelecimento bem-sucedido de culturas de organoides. Atualize o meio a cada 2-3 dias. Certifique-se de que o meio está quente para evitar a dissociação da matriz sensível à temperatura. Realizar análises do experimento 6 a 8 dias após o plaqueamento. Os organoides podem ser mantidos em cultura por até 14 dias. Por volta do 14º dia, observa-se perda da integridade da cúpula. 6. Passagem de organoides NOTA: A passagem de organoides cultivados em co-cultura resulta na perda de fibroblastos. Portanto, recomenda-se o uso do meio ENR para todos os organoides quando passados. Pré-aquecer ENR, PBS e uma placa de 48 poços a 37 °C. Retire o meio e lave o poço que contém a cúpula matricial com PBS pré-aquecido. Adicionar 200 μL de solução fria de tripsina a 0,25% e pipetar para cima e para baixo para quebrar a cúpula da matriz.OBS: Recomenda-se o uso de tripsina a 0,25% a frio, pois a matriz é sensível à temperatura e isso auxilia na quebra das cúpulas da matriz. Incubar os organoides com tripsina a 37 °C durante ~20 min. Pipetar para cima e para baixo após 10 min para aumentar a dissociação dos organoides. Monitore o processo de dissociação com um microscópio a cada 5-10 min. Como a tripsina diminui a viabilidade celular, isso pode ajudar a identificar o tempo ideal de dissociação. Após 20 min, pipetar os organoides para cima e para baixo com uma pipeta de 200 μL para dissociar os organoides. Coletar as células em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL, adicionar 1 mL de meio organoide básico e centrifugar a 300 x g por 5 min na RT. Opcional: Para garantir as melhores condições de crescimento organoide e que os novos organoides sejam derivados de células únicas, coe as células através de um filtro celular pré-molhado de 40 μm. A filtragem da suspensão celular resulta na remoção de núcleos organoides e aglomerados celulares que são difíceis de dissociar. Preparar uma matriz composta por 80% de matriz e 20% de meio organoide básico frio. Coloque tudo no gelo, pois a matriz se solidifica no RT. Eliminar o sobrenadante retirando-o cuidadosamente com uma pipeta de 200 μL, ressuspender as células em 10 μL de mistura/cúpula de matriz e recolocar a mistura no gelo.NOTA: Os organoides podem ser divididos em uma proporção de 1:5 para 1:10, dependendo da densidade da cúpula. As células epiteliais também podem ser contadas e replaqueadas a 5.000 células/cúpula. Pegue a placa pré-aquecida de 48 poços da incubadora de 37 °C e faça uma cúpula por poço. Transfira a placa de cabeça para baixo para uma incubadora e deixe as cúpulas solidificarem por mais 20-30 min a 37 °C. Adicionar 200 μL de meio ENR pré-aquecido às respectivas cúpulas organoides. Completar o meio com 10 μM de inibidor de rocha (Y-27623) durante os primeiros 2 dias. Atualize o meio a cada 2-3 dias. Certifique-se de que o meio está quente para evitar a dissociação da matriz sensível à temperatura. 7. Processamento organoide para coloração de montagem inteira NOTA: Revestir as pontas e tubos com 10% de FBS em PBS antes de usar para evitar organoides aderidos aos plásticos. Para pontas de pipeta, basta pipetar uma ou duas vezes para cima e para baixo em solução FBS/PBS a 10% antes de usar a ponteira. Para tubos, encha o tubo com FBS/PBS a 10% e, em seguida, remova a solução. Remova o meio organoide e adicione 200 μL de PBS gelado às cúpulas da matriz. Coloque a placa no gelo por 5-10 min. Pipetar para cima e para baixo e transferir a solução para tubos não aderentes de microcentrífuga de 0,6 mL. Centrifugar logo por 30-60 s a 100 x g para deixar os organoides se acomodarem no fundo.NOTA: O excesso de pipetagem e centrifugação longa quebra os organoides e interrompe a interação fibroblasto-organóide. Retire o excesso de líquido e adicione PBS gelado. Centrifugar logo por 30-60 s a 100 x g para deixar os organoides se acomodarem no fundo. Retire o excesso de líquido e fixe o organoide com 200 μL de formaldeído a 4% gelado em solução PBS durante 30 minutos no gelo.CUIDADO: O formaldeído é tóxico e deve ser sempre usado em uma capela de fumaça química. Luvas de nitrilo, óculos de segurança e jalecos devem ser sempre usados. A fixação do organoide faz com que eles afundem, e a centrifugação não é mais necessária. Deixe os organoides afundarem colocando o tubo na vertical e aguarde 2-3 min, remova o formaldeído e adicione 500 μL de PBS frio para lavar o formaldeído. Deixe os organoides afundarem, remova o excesso de PBS e adicione 500 μL de PBS fresco e frio. Deixe os organoides afundarem, remova o excesso de PBS e adicione 500 μL de tampão de bloqueio (5% de soro de burro normal, 1% de BSA e 0,5% de Triton X-100 em PBS). Coloque o tubo em um balancim por 60 min no RT.NOTA: O bloqueio também pode ser feito durante a noite (O/N) a 4 °C. Deixe os organoides afundarem, remova o tampão de bloqueio e ressuspenda os organoides em 200 μL de tampão de bloqueio com anticorpos primários (ver Tabela de Materiais). Manter os organoides num agitador O/N a 4 °C.NOTA: Para melhorar a coloração de proteínas nucleares, proteínas de baixa expressão ou anticorpos que mostram coloração inespecífica, o tempo de incubação pode ser aumentado por 1 ou 2 dias a 4 °C. Colocar os organoides em um agitador de balancim é essencial, pois evita que os organoides se aglutinem e aumenta a eficiência da coloração. Deixe os organoides afundarem, remova a mistura primária de anticorpos e lave os organoides usando 500 μL de Triton X-100 a 0,02% em PBS (0,02% Tx) por 60 min em RT. Repita três vezes.NOTA: Quando for necessária uma incubação de anticorpos primários mais longa, adicione uma etapa de lavagem com 0,02% de Tx em PBS O/N a 4 °C. Deixe os organoides afundarem, remova o tampão de lavagem e adicione 200 μL de anticorpo secundário conjugado com fluorescência no tampão de bloqueio O/N a 4 °C. Depois de adicionar anticorpos secundários fluorescentes, mantenha os organoides no escuro para evitar o clareamento do sinal. Deixe os organoides afundarem, remova a mistura de anticorpos secundários e lave os organoides usando 500 μL de Tx 0,02% por 60 minutos na RT. Repita três vezes. Contramanchar os organoides com 200 μL de solução de DAPI (0,25 μg/mL) para coloração nuclear, se necessário. Incubar as amostras por 60 min em RT em um balancim. Deixe os organoides afundarem, remova a solução de DAPI e lave os organoides em 500 μL de PBS por 15 minutos na RT. Repita três vezes. Deixe os organoides afundarem e remova todo o excesso de líquido. Adicionar 10 μL de solução de limpeza aos organoides e incubar durante 15 minutos em RT.NOTA: A solução de compensação é viscosa, pelo que corte a parte exterior de uma ponta de pipeta de 20 μL antes de pipetar a solução de compensação. Mais solução de limpeza pode ser adicionada se um espaçador maior for usado para geração de imagens. A solução de montagem pode ser usada em vez da solução de limpeza quando não limpar os organoides. A solução de limpeza reduz o plano de fundo durante a criação de imagens e aumenta a profundidade da imagem. Coloque um espaçador de 4 poços adesivo de dupla face de 0,05 mm em uma lâmina de microscópio. Adicione os 10 μL da solução de limpeza com os organoides num poço e coloque uma tampa por cima do espaçador.NOTA: Os organoides também podem ser montados sem o uso de espaçador. O espaçador mantém a forma organoide intacta e impede que os organoides sejam achatados. Mantenha a lâmina em RT O/N para limpar os organoides. Para armazenamento a longo prazo, mantenha as lâminas a 4 °C. Adquirir imagens utilizando um sistema de microscopia confocal.