从野生型猕猴获得的视网膜外植体在 体外培养。视网膜变性和cGMP-PKG信号通路使用PDE6抑制剂扎匹司特诱导。使用免疫荧光法验证不同浓度的扎普瑞斯特外植体中的cGMP积累。
遗传性视网膜变性(RD)的特征是进行性感光细胞死亡。光感受器细胞中环鸟苷单磷酸(cGMP)依赖性蛋白激酶(PKG)途径的过度激活会导致感光细胞死亡,特别是在携带磷酸二酯酶6b(PDE6b)突变的模型中。以前对RD的研究主要使用小鼠模型,如 rd1 或 rd10 小鼠。鉴于小鼠和人类之间的遗传和生理差异,重要的是要了解灵长类动物和啮齿动物的视网膜在多大程度上具有可比性。猕猴与人类具有高度的遗传相似性。因此,选择野生型猕猴(年龄1-3岁)进行视网膜外植体的 体外 培养,其中包括视网膜-视网膜色素上皮(RPE)-脉络膜复合物。用不同浓度的PDE6抑制剂扎普利纳斯特处理这些外植体,诱导cGMP-PKG信号通路并模拟RD发病机制。随后使用免疫荧光和TUNEL测定法验证灵长类动物视网膜外植体中的cGMP积累和细胞死亡。本研究建立的灵长类动物视网膜模型可用于cGMP-PKG依赖性RD机制的相关有效研究,以及未来治疗方法的开发。
遗传性视网膜变性(RD)的特征是进行性感光细胞死亡,由多种致病基因突变引起1。RD的最终结果是视力丧失,在绝大多数情况下,这种疾病至今仍无法治愈。因此,使用忠实代表人类疾病状况的模型研究导致光感受器死亡的细胞机制非常重要。在这里,基于灵长类动物的模型因其与人类的接近而特别令人感兴趣。值得注意的是,这些模型可能会促进适当的治疗干预措施的开发,这些干预措施可以阻止或延缓感光细胞死亡。
先前对RD中细胞死亡机制的研究表明,由RD触发基因突变引起的磷酸二酯酶6(PDE6)活性的降低或丧失导致环鸟苷单磷酸(cGMP)的水解减少2,3。cGMP是杆外段(ROS)中环核苷酸门控离子通道(CNGCs)的特异性激动剂,也是负责脊椎动物感光细胞中光信号转化为电信号的关键分子4。cGMP水解减少导致cGMP在ROS中积累,导致CNGCs的开放5。因此,光转导途径被激活,导致感光细胞中阳离子浓度的增加。这个过程给光感受器带来了代谢负担,当光感受器过度激活时,例如,通过PDE6的突变,可能导致细胞死亡。
许多研究表明,具有不同RD基因突变的小鼠模型的光感受器中cGMP的显着过度积累可能导致cGMP依赖性蛋白激酶(PKG)的活化3,6。这导致垂死的TUNEL阳性细胞的显着增加和感光细胞层的逐渐变薄。先前的研究表明,由cGMP水平升高引起的PKG过度激活是诱导感光细胞死亡的必要和充分条件2,5。对不同小鼠RD模型的研究还表明,光感受器中cGMP水平升高诱导的PKG活化导致下游效应物的过度激活,例如聚ADP-核糖聚合酶1(PARP1),组蛋白脱乙酰酶(HDAC)和钙蛋白酶2,7,8,9。这意味着这些不同的靶蛋白与感光细胞死亡之间存在因果关系。
然而,先前关于RD的病理学,毒理学和治疗的研究主要基于RD10,11,12的小鼠模型。然而,这些结果的临床转化仍然存在巨大的困难。这是由于小鼠和人类之间存在相当大的遗传和生理差异,特别是在视网膜结构方面。相比之下,非人灵长类动物(NHP)在遗传特征,生理模式和环境因素调节方面也与人类高度相似。例如,在NHP模型中,光遗传学疗法被研究为恢复视网膜活动的手段13。Lingam及其同事证明,良好生产规范级人诱导的多能干细胞衍生的视网膜感光器前体细胞可以挽救NHP14中的视锥光感受器损伤。因此,非人灵长类模型对于探索RD发病机制和开发有效的治疗方法具有重要意义。特别是,RD的非人灵长类模型表现出与人类相似的致病机制,可以在新药开发和体内毒理学分析研究中发挥关键作用。
鉴于建立 体内 灵长类动物模型生命周期长、技术难度高、成本高等问题,我们利用体外猕猴视网膜培养物建立了 体外 非人灵长类动物(NHP)模型。首先,选择1-3岁的野生型猕猴进行视网膜外植体体 外培养, 其中包括视网膜-RPE-脉络膜复合体。然后用不同浓度的PDE6抑制剂zaprinast (100 μM、200 μM 和 400 μM)处理外植体以诱导cGMP-PKG信号通路。使用TUNEL测定法定量和分析感光细胞死亡,并通过免疫荧光 验证 外植体中的cGMP积累。鉴于猴与人类在细胞分布和形态、视网膜层厚度等视网膜生理特征方面高度相似,在 体外 视网膜模型中建立cGMP-PKG信号通路可能有助于未来RD发病机制的研究以及RD治疗新药的开发和毒理学研究。
视觉光转导是指光信号被眼睛视网膜内的感光细胞转换为电信号的生物过程。感光细胞是能够进行光转导的极化神经元,并且有两种不同类型的感光器在其外段的形状之后称为杆状和视锥。视杆细胞负责暗视觉,视锥细胞负责明视和高敏视力。遗传性RD涉及以进行性视网膜感光细胞死亡为特征的神经退行性疾病15。
目前对RD的研究主要基于RD的小鼠模型,包括…
The authors have nothing to disclose.
本研究得到了国家自然科学基金(第81960180号)、津科遗产基金会和云南省眼病临床医学中心夏洛特和蒂斯托克斯坦基金会的资助(ZX2019-02-01)。我们感谢吕龙宝教授(中国科学院动物研究所,中国昆明)分享本研究中使用的猴眼球。
Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | B2064 | Blocking solution |
Corticosterone | Sigma | C2505 | Supplements of Complete Medium |
DL-tocopherol | Sigma | T1539 | Supplements of Complete Medium |
Donkey anti sheep, Alxea Fluor 488 | Life technologies corporation | A11015 | Secondary antibody of cGMP |
Ethanol-acetic acid solution | Shyuanye | R20492 | Fixing liquid |
Fetal Bovine Serum | Gemini | 900-108 | Blocking solution |
Fluorescence microscope | Carl Zeiss | Axio Imager.M2 | Immunofluorescence imaging |
Glutamine | Sigma | G8540 | Supplements of Complete Medium |
Glutathione | Sigma | G6013 | Supplements of Complete Medium |
In Situ Cell Death Detection Kit, TMR red | Roche | 12156792910 | TUNEL assay |
Insulin | Sigma | 16634 | Supplements of Complete Medium |
L-cysteine HCl | Sigma | C7477 | Supplements of Complete Medium |
Linoleic acid | Sigma | L1012 | Supplements of Complete Medium |
MACS Tissue Storage Solution | Miltenyi | 130-100-008 | Optimized storage of fresh organ and tissue samples |
Normal Donkey Serum | Solarbio | SL050 | Blocking solution |
Paraformaldehyde(PFA) | Biosharp | BL539A | Fixing agent |
PEN. / STREP. 100× | Millipore | TMS-AB2-C | Penicillin / Streptomycin antibiotics |
Phosphate buffer saline(PBS) | Solarbio | P1010 | Buffer solution |
Povidone-iodine | Shanghailikang | 310411 | Disinfector agent |
Progesterone | Sigma | P8783 | Supplements of Complete Medium |
Proteinase K | Millpore | 539480 | Break down protein |
R16 medium | Life technologies corporation | 074-90743A | Basic medium |
Retinol | Sigma | R7632 | Supplements of Complete Medium |
Retinyl acetate | Sigma | R7882 | Supplements of Complete Medium |
Sheep anti-cGMP | Jan de Vente, Maastricht University, the Netherlands | Primary antibody of cGMP | |
Sucrose | GHTECH | 57-50-1 | Dehydrating agent |
T3 | Sigma | T6397 | Supplements of Complete Medium |
Tissue-Tek medium (O.C.T. Compound) | SAKURA | 4583 | Embedding medium |
Tocopheryl acetate | Sigma | T1157 | Supplements of Complete Medium |
Transferrin | Sigma | T1283 | Supplements of Complete Medium |
Transwell | Corning Incorporated | 3412 | Cell / tissue culture |
Tris-buffer (TBS) | Solarbio | T1080 | Blocking buffer |
Triton X-100 | Solarbio | 9002-93-1 | Surface active agent |
VECTASHIELD Medium with DAPI | Vector | H-1200 | Mounting medium |
Vitamin B1 | Sigma | T1270 | Supplements of Complete Medium |
Vitamin B12 | Sigma | V6629 | Supplements of Complete Medium |
Vitamin C | Sigma | A4034 | Supplements of Complete Medium |
Zaprinast | Sigma | Z0878 | PDE6 inhibitor |
Zeiss Imager M2 Microscope | Zeiss, Oberkochen,Germany | upright microscope | |
LSM 900 Airyscan | high resolution laser scanning microscope | ||
Zeiss Axiocam | Zeiss, Oberkochen,Germany | digital camera | |
Zeiss Axiovision4.7 | |||
Adobe | |||
Illustrator CC 2021 (Adobe Systems Incorporated, San Jose, CA) | |||
Primate eyeballs from wildtype macaque | KUNMING INSTITUTE OF ZOOLOGY | SYXK () K2017 -0008 | |
Super Pap Pen Pen (Liquid Blocker, Diado, 0010, Japan | |||
TUNEL kit solution (REF12156792910, Roche,Germany), |