Cultivos organotípicos de explante retiniano de mono macaco

La degeneración retiniana hereditaria (DR) se caracteriza por la muerte celular fotorreceptora progresiva y es causada por mutaciones en una amplia variedad de genes patógenos¹. El resultado final de la RD es la pérdida de visión y en la gran mayoría de los casos la enfermedad sigue siendo intratable hasta el día de hoy. Por lo tanto, es importante estudiar los mecanismos celulares que conducen a la muerte de los fotorreceptores utilizando modelos que representen fielmente la condición de la enfermedad humana. Aquí, los modelos basados en primates son de particular interés debido a su cercanía con los humanos. En particular, tales modelos pueden avanzar en el desarrollo de intervenciones terapéuticas apropiadas que pueden detener o retrasar la muerte de las células fotorreceptoras.

Investigaciones previas sobre los mecanismos de muerte celular en la DR han demostrado que la disminución o pérdida de la actividad de la fosfodiesterasa 6 (PDE6) causada por mutaciones del gen desencadenante de la DR conduce a una hidrólisis reducida del monofosfato de guanosina cíclico (^GMPc)2,3. El GMPc es un agonista específico de los canales iónicos dependientes de nucleótidos cíclicos (CNGC) en los segmentos externos de bastones (ROS) y también es una molécula clave responsable de la conversión de señales luminosas en señales eléctricas en células fotorreceptoras de vertebrados⁴. La hidrólisis reducida de cGMP provoca la acumulación de cGMP en ROS, lo que lleva a la apertura de CNGC ⁵. En consecuencia, las vías de fototransducción se activan, lo que resulta en un aumento de las concentraciones de cationes en las células fotorreceptoras. Este proceso impone una carga metabólica a los fotorreceptores, que cuando se sobreactivan, por ejemplo, por mutaciones en la PDE6, pueden causar la muerte celular.

Muchos estudios han demostrado que una sobreacumulación significativa de GMPc en fotorreceptores de modelos de ratón con diferentes mutaciones del gen RD puede causar la activación de la proteína quinasa dependiente de cGMP (PKG)^3,6. Esto conduce a un aumento sustancial de las células moribundas positivas para TUNEL y un adelgazamiento gradual de la capa celular fotorreceptora. Estudios previos sugieren que la sobreactivación del PKG causada por niveles elevados de GMPc es una condición necesaria y suficiente para la inducción de la muerte celular fotorreceptora ^2,5. Los estudios en diferentes modelos de ratón de RD también han demostrado que la activación de PKG inducida por niveles elevados de cGMP en fotorreceptores, conduce a la sobreactivación de efectores aguas abajo como la poli-ADP-ribosa polimerasa 1 (PARP1), histona deacetilasa (HDAC) y calpaína 2,7,8,9. Esto implica asociaciones causales entre estas diferentes proteínas diana y la muerte celular fotorreceptora.

Sin embargo, la investigación previa sobre la patología, toxicofarmacología y terapia de la DR se basó principalmente en modelos de ratón para la DR^10,11,12. Sin embargo, siguen existiendo inmensas dificultades en la traducción clínica de estos resultados. Esto se debe a las considerables diferencias genéticas y fisiológicas entre ratones y humanos, especialmente con respecto a la estructura retiniana. En contraste, los primates no humanos (NHP) también comparten un alto grado de similitud con los humanos con respecto a las características genéticas, los patrones fisiológicos y la regulación de los factores ambientales. Por ejemplo, la terapia optogenética fue investigada como un medio para restaurar la actividad retiniana en un modelo NHP¹³. Lingam y sus colegas demostraron que las células precursoras de fotorreceptores de retina derivadas de células madre pluripotentes inducidas por humanos de buena fabricación pueden rescatar el daño de los fotorreceptores de cono en NHP¹⁴. Por lo tanto, los modelos de NHP son importantes para la exploración de la patogénesis de la DR y el desarrollo de métodos de tratamiento efectivos. En particular, los modelos NHP de DR, que exhiben mecanismos patogénicos similares a los de los humanos, podrían desempeñar un papel crítico en los estudios sobre el desarrollo y el análisis toxicofarmacológico in vivo de nuevos fármacos.

En vista del largo ciclo de vida, el alto nivel de dificultades técnicas y el alto costo involucrado en el establecimiento de modelos de primates in vivo , establecimos un modelo de primates no humanos in vitro (NHP) utilizando cultivos de retina de macaco explantada. En primer lugar, se seleccionaron macacos de tipo silvestre de 1 a 3 años para el cultivo in vitro de explantes de retina, que incluía el complejo retina-RPE-coroides. Los explantes se trataron con diferentes concentraciones del inhibidor de la PDE6 zaprinast (100 μM, 200 μM y 400 μM) para inducir la vía de señalización cGMP-PKG. La muerte celular fotorreceptora se cuantificó y analizó mediante el ensayo TUNEL, y la acumulación de cGMP en explantes se verificó mediante inmunofluorescencia. Dado el alto grado de similitud con respecto a la distribución celular y la morfología, el grosor de la capa retiniana y otras características fisiológicas de la retina entre monos y humanos, el establecimiento de la vía de señalización cGMP-PKG en el modelo retiniano in vitro puede facilitar futuras investigaciones sobre la patogénesis de la DR, así como estudios sobre el desarrollo y la toxicofarmacología de nuevos fármacos para el tratamiento de la DR.