Summary

マカクザルの有機型網膜外植片培養

Published: August 24, 2022
doi:

Summary

野生型マカクから得られた網膜外植体を インビトロで培養した。網膜変性およびcGMP−PKGシグナル伝達経路は、PDE6阻害剤ザプリナストを用いて誘導した。異なるザプリナスト濃度の外植体におけるcGMP蓄積は、免疫蛍光法を用いて検証された。

Abstract

遺伝性網膜変性症(RD)は、進行性の視細胞死を特徴とする。光受容体細胞における環状グアノシン一リン酸(cGMP)依存性プロテインキナーゼ(PKG)経路の過剰活性化は、特にホスホジエステラーゼ6b(PDE6b)変異を有するモデルにおいて、光受容体細胞死を引き起こす。RDに関する以前の研究では、主に rd1 または rd10 マウスなどのマウスモデルが使用されてきました。マウスとヒトの遺伝的および生理学的な違いを考えると、霊長類とげっ歯類の網膜がどの程度同等であるかを理解することが重要です。マカクザルは人間と高いレベルの遺伝的類似性を共有しています。したがって、野生型マカク(1〜3歳)を、網膜-網膜色素上皮(RPE)-脈絡膜複合体を含む網膜外植片の in vitro 培養に選択しました。これらの外植片を異なる濃度のPDE6阻害剤ザプリナストで処理して、cGMP-PKGシグナル伝達経路を誘導し、RD病因をシミュレートしました。その後、霊長類網膜外植片におけるcGMP蓄積および細胞死を、免疫蛍光法およびTUNELアッセイを用いて検証した。本研究で確立された霊長類網膜モデルは、cGMP-PKG依存性RDのメカニズムに関する関連性のある効果的な研究、および将来の治療アプローチの開発に役立つ可能性があります。

Introduction

遺伝性網膜変性症(RD)は、進行性の視細胞死を特徴とし、多種多様な病原性遺伝子の変異によって引き起こされます1。RDの最終結果は視力喪失であり、ほとんどの場合、この病気は今日まで治療できないままです。したがって、光受容体死に至る細胞機構を、ヒトの病態を忠実に表現したモデルを用いて研究することが重要です。ここでは、霊長類ベースのモデルは、人間に近いため、特に興味深いものです。特に、このようなモデルは、視細胞死を停止または遅延させることができる適切な治療的介入の開発を進める可能性がある。

RDの細胞死メカニズムに関するこれまでの研究では、RDを誘発する遺伝子変異によって引き起こされるホスホジエステラーゼ6(PDE6)活性の低下または喪失が、環状グアノシン一リン酸(cGMP)の加水分解の減少につながることが示されています2,3。cGMPは、桿体外側セグメント(ROS)の環状ヌクレオチド依存性イオンチャネル(CNGC)の特異的アゴニストであり、脊椎動物の視細胞における光信号の電気信号への変換に関与する重要な分子でもあります4。cGMP加水分解の減少は、ROS中のcGMPの蓄積を引き起こし、CNGCの開放をもたらす5。その結果、光伝達経路が活性化され、その結果、光受容体細胞における陽イオン濃度が増加する。このプロセスは光受容体に代謝負荷を課し、例えばPDE6の突然変異によって過剰に活性化されると、細胞死を引き起こす可能性があります。

多くの研究により、RD遺伝子変異の異なるマウスモデルの光受容体におけるcGMPの有意な過剰蓄積が、cGMP依存性プロテインキナーゼ(PKG)の活性化を引き起こす可能性があることが示されています3,6。これは、死にかけているTUNEL陽性細胞の大幅な増加および視細胞層の漸進的な薄化をもたらす。以前の研究では、cGMPレベルの上昇によって引き起こされるPKGの過剰活性化が、視細胞死の誘導に必要かつ十分な条件であることが示唆されています2,5。RDのさまざまなマウスモデルに関する研究では、光受容体のcGMPレベルの上昇によって誘導されるPKG活性化が、ポリ-ADP-リボースポリメラーゼ1(PARP1)、ヒストンデアセチラーゼ(HDAC)、およびカルパイン2,7,8,9などの下流エフェクターの過剰活性化につながることも示されています。これは、これらの異なる標的タンパク質と視細胞死との因果関係を示唆しています。

しかし、RDの病理学、毒物薬理学、および治療に関する以前の研究は、主にRD 101112のマウスモデルに基づいていました。それにもかかわらず、これらの結果の臨床翻訳には計り知れない困難が残っています。これは、特に網膜構造に関して、マウスとヒトの間にかなりの遺伝的および生理学的違いがあるためです。対照的に、非ヒト霊長類(NHP)は、遺伝的特徴、生理学的パターン、および環境要因調節に関してもヒトと高度な類似性を共有しています。例えば、NHPモデル13における網膜活性を回復させる手段として、光遺伝学的治療が検討された。今回、Lingamたちの研究グループは、優れた製造基準級のヒト誘導多能性幹細胞由来網膜視細胞前駆細胞が、NHP14の錐体光受容体損傷を救済できることを実証した。したがって、NHPモデルは、RDの病因の探索と効果的な治療法の開発に重要です。特に、ヒトと同様の病原性メカニズムを示すRDのNHPモデルは、新薬の開発やin vivo毒性薬理学的解析の研究に重要な役割を果たす可能性があります。

di vivo 霊長類モデルの確立には、ライフサイクルの長期化、技術的困難度の高さ、コストの高さを考慮すると、外植したマカク網膜の培養を用いた in vitro 非ヒト霊長類(NHP)モデルを確立しました。まず、1〜3歳の野生型マカクを、網膜-RPE-脈絡膜複合体を含む網膜外植片の in vitro 培養用に選択した。次に、外植片を異なる濃度のPDE6阻害剤ザプリナスト(100 μM、200 μM、および400 μM)で処理して、cGMP-PKGシグナル伝達経路を誘導しました。TUNELアッセイを用いて視細胞死を定量・解析し、外植体におけるcGMP蓄積を免疫蛍光法 検証した。サルとヒトの網膜の細胞分布や形態、網膜層厚などの生理的特徴の類似性が高いことから、 in vitro 網膜モデルにおけるcGMP-PKGシグナル伝達経路の確立は、RDの病態解明やRD治療薬の開発・毒性薬理学の研究の進展につながることが期待されます。

Protocol

動物実験は、中国科学院動物学研究所の倫理審査委員会(IACUC-PE-2022-06-002)、および雲南大学の動物倫理審査および動物プロトコル(YNU20220149)によってレビューおよび承認されました。 1.網膜外植片の調製 1〜3歳の野生型マカクから霊長類の眼球を入手し、組織保存液に保存し、サルを屠殺した後または自然死後、除核から3時間以内に氷上で輸送します。…

Representative Results

本研究では、網膜-RPE-脈絡膜複合体を含む外植片を用いてマカクザル網膜外植片培養を行った(図1、 補足図S1)。RPEや脈絡膜を付着させない網膜を用いた網膜細胞の in vitro 培養と比較して、当社の外植片培養は細胞の生存率を高め、視細胞の寿命を延ばします。 異なる濃度のPDE6阻害剤ザプリナスト(100 μM、200 μM、および400 μM; <stro…

Discussion

視覚光伝達とは、光信号が眼の網膜内の光受容体細胞によって電気信号に変換される生物学的プロセスを指します。視細胞は光伝達が可能な偏光ニューロンであり、光受容体には、その外側のセグメントの形状にちなんで桿体と錐体と呼ばれる2つの異なるタイプがあります。桿体は暗所視に責任があり、錐体は明所視と高視力に責任があります。遺伝性RDは、進行性の網膜視細胞死を特徴と?…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

この研究は、中国国家自然科学財団(第81960180号)、ジンケ遺産財団、および雲南眼疾患臨床医療センターのシャーロットアンドティストウケルスタン財団からの助成金によって支援されました(ZX2019-02-01)。Longbao Lv教授(中国科学院動物学研究所、昆明、中国)には、この研究で使用したサルの眼球を共有していただき、感謝します。

Materials

Bovine Serum Albumin (BSA) Sigma B2064 Blocking solution
Corticosterone Sigma C2505 Supplements of Complete Medium
DL-tocopherol Sigma T1539 Supplements of Complete Medium
Donkey anti sheep, Alxea Fluor 488 Life technologies corporation A11015 Secondary antibody of cGMP
Ethanol-acetic acid solution Shyuanye R20492 Fixing liquid
Fetal Bovine Serum Gemini 900-108 Blocking solution
Fluorescence microscope Carl Zeiss Axio Imager.M2 Immunofluorescence imaging
Glutamine Sigma G8540 Supplements of Complete Medium
Glutathione Sigma G6013 Supplements of Complete Medium
In Situ Cell Death Detection Kit, TMR red Roche 12156792910 TUNEL assay
Insulin Sigma 16634 Supplements of Complete Medium
L-cysteine HCl Sigma C7477 Supplements of Complete Medium
Linoleic acid Sigma L1012 Supplements of Complete Medium
MACS Tissue Storage Solution Miltenyi 130-100-008 Optimized storage of fresh organ and tissue samples
Normal Donkey Serum Solarbio SL050 Blocking solution
Paraformaldehyde(PFA) Biosharp BL539A Fixing agent
PEN. / STREP. 100× Millipore TMS-AB2-C Penicillin / Streptomycin antibiotics
Phosphate buffer saline(PBS) Solarbio P1010 Buffer solution
Povidone-iodine Shanghailikang 310411 Disinfector agent
Progesterone Sigma P8783 Supplements of Complete Medium
Proteinase K Millpore 539480 Break down protein
R16 medium Life technologies corporation 074-90743A Basic medium
Retinol Sigma R7632 Supplements of Complete Medium
Retinyl acetate Sigma R7882 Supplements of Complete Medium
Sheep anti-cGMP Jan de Vente, Maastricht University, the Netherlands Primary antibody of cGMP
Sucrose GHTECH 57-50-1 Dehydrating agent
T3 Sigma T6397 Supplements of Complete Medium
Tissue-Tek medium (O.C.T. Compound) SAKURA 4583 Embedding medium
Tocopheryl acetate Sigma T1157 Supplements of Complete Medium
Transferrin Sigma T1283 Supplements of Complete Medium
Transwell Corning Incorporated 3412 Cell / tissue culture
Tris-buffer (TBS) Solarbio T1080 Blocking buffer
Triton X-100 Solarbio 9002-93-1 Surface active agent
VECTASHIELD Medium with DAPI Vector H-1200 Mounting medium
Vitamin B1 Sigma T1270 Supplements of Complete Medium
Vitamin B12 Sigma V6629 Supplements of Complete Medium
Vitamin C Sigma A4034 Supplements of Complete Medium
Zaprinast Sigma Z0878 PDE6 inhibitor
Zeiss Imager M2 Microscope  Zeiss, Oberkochen,Germany upright microscope
LSM 900 Airyscan high resolution laser scanning microscope
Zeiss Axiocam  Zeiss, Oberkochen,Germany digital camera
Zeiss Axiovision4.7
Adobe
Illustrator CC 2021 (Adobe Systems Incorporated, San Jose, CA)
Primate eyeballs from wildtype macaque KUNMING INSTITUTE OF ZOOLOGY SYXK (Equation 1) K2017 -0008
Super Pap Pen Pen (Liquid Blocker, Diado, 0010, Japan
TUNEL kit solution (REF12156792910, Roche,Germany),

Riferimenti

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Citazione di questo articolo
Xu, W., Dong, Y., Li, Y., Hu, Z., Paquet-Durand, F., Jiao, K. Organotypic Retinal Explant Cultures from Macaque Monkey. J. Vis. Exp. (186), e64178, doi:10.3791/64178 (2022).

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