猕猴的器官型视网膜外植体培养物

遗传性视网膜变性（RD）的特征是进行性感光细胞死亡，由多种致病基因突变引起¹。RD的最终结果是视力丧失，在绝大多数情况下，这种疾病至今仍无法治愈。因此，使用忠实代表人类疾病状况的模型研究导致光感受器死亡的细胞机制非常重要。在这里，基于灵长类动物的模型因其与人类的接近而特别令人感兴趣。值得注意的是，这些模型可能会促进适当的治疗干预措施的开发，这些干预措施可以阻止或延缓感光细胞死亡。

先前对RD中细胞死亡机制的研究表明，由RD触发基因突变引起的磷酸二酯酶6（PDE6）活性的降低或丧失导致环鸟苷单磷酸（cGMP^）的水解减少2^，3。cGMP是杆外段（ROS）中环核苷酸门控离子通道（CNGCs）的特异性激动剂，也是负责脊椎动物感光细胞中光信号转化为电信号的关键分子⁴。cGMP水解减少导致cGMP在ROS中积累，导致^CNGCs的开放5。因此，光转导途径被激活，导致感光细胞中阳离子浓度的增加。这个过程给光感受器带来了代谢负担，当光感受器过度激活时，例如，通过PDE6的突变，可能导致细胞死亡。

许多研究表明，具有不同RD基因突变的小鼠模型的光感受器中cGMP的显着过度积累可能导致cGMP依赖性蛋白激酶（PKG）的活化^3，6。这导致垂死的TUNEL阳性细胞的显着增加和感光细胞层的逐渐变薄。先前的研究表明，由cGMP水平升高引起的PKG过度激活是诱导感光细胞死亡的必要和充分条件^2，5。对不同小鼠RD模型的研究还表明，光感受器中cGMP水平升高诱导的PKG活化导致下游效应物的过度激活，例如聚ADP-核糖聚合酶1（PARP1），组蛋白脱乙酰酶（HDAC）和钙蛋白酶²，⁷，^8，9。这意味着这些不同的靶蛋白与感光细胞死亡之间存在因果关系。

然而，先前关于RD的病理学，毒理学和治疗的研究主要基于RD¹⁰，^11，12的小鼠模型。然而，这些结果的临床转化仍然存在巨大的困难。这是由于小鼠和人类之间存在相当大的遗传和生理差异，特别是在视网膜结构方面。相比之下，非人灵长类动物（NHP）在遗传特征，生理模式和环境因素调节方面也与人类高度相似。例如，在NHP模型中，光遗传学疗法被研究为恢复视网膜活动的手段¹³。Lingam及其同事证明，良好生产规范级人诱导的多能干细胞衍生的视网膜感光器前体细胞可以挽救NHP¹⁴中的视锥光感受器损伤。因此，非人灵长类模型对于探索RD发病机制和开发有效的治疗方法具有重要意义。特别是，RD的非人灵长类模型表现出与人类相似的致病机制，可以在新药开发和体内毒理学分析研究中发挥关键作用。

鉴于建立 体内 灵长类动物模型生命周期长、技术难度高、成本高等问题，我们利用体外猕猴视网膜培养物建立了 体外 非人灵长类动物（NHP）模型。首先，选择1-3岁的野生型猕猴进行视网膜外植体体 外培养， 其中包括视网膜-RPE-脉络膜复合体。然后用不同浓度的PDE6抑制剂zaprinast （100 μM、200 μM 和 400 μM）处理外植体以诱导cGMP-PKG信号通路。使用TUNEL测定法定量和分析感光细胞死亡，并通过免疫荧光 验证 外植体中的cGMP积累。鉴于猴与人类在细胞分布和形态、视网膜层厚度等视网膜生理特征方面高度相似，在 体外 视网膜模型中建立cGMP-PKG信号通路可能有助于未来RD发病机制的研究以及RD治疗新药的开发和毒理学研究。