Protokol, sinaptik membranların Xenopus laevis oositlerine mikrotransplantasyonunu gerçekleştirerek, α-amino-3-hidroksi-5-metil-4-izoksazolepropiyonik asit ve γ-aminobütirik asit reseptörlerinin tutarlı ve güvenilir yanıtlarını kaydetmenin mümkün olduğunu göstermektedir.
Uyarıcı ve inhibitör iyonotropik reseptörler, fizyolojik nöronal iletişim sırasında sinapsların aktivitesini belirleyen iyon akılarının başlıca kapılarıdır. Bu nedenle, bollukları, işlevleri ve diğer sinaptik elementlerle olan ilişkilerindeki değişiklikler, nörodejeneratif hastalıklarda ve zihinsel bozukluklarda beyin fonksiyonlarındaki değişikliklerin ve bilişsel bozulmanın önemli bir korelasyonu olarak gözlenmiştir. Uyarıcı ve inhibitör sinaptik reseptörlerin fonksiyonlarının hastalık tarafından nasıl değiştirildiğini anlamak, etkili tedavilerin geliştirilmesi için kritik öneme sahiptir. Hastalıkla ilgili bilgi edinmek için, hastalıklı insan beyninde işlevsel kalan nörotransmitter reseptörlerinin elektriksel aktivitesini kaydetmek önemlidir. Şimdiye kadar bu, reseptörlerin fonksiyonundaki patolojik değişiklikleri değerlendirmek için en yakın yaklaşımdır. Bu çalışmada, insan reseptörleri içeren donmuş insan beyin dokusundan sinaptik membranların Xenopus laevis oositlerinin membranına enjeksiyonu ve posterior füzyonu ile yeniden aktive edilmesinden oluşan sinaptik membranların mikrotransplantasyonunu gerçekleştirmek için bir metodoloji sunulmuştur. Protokol ayrıca, α-amino-3-hidroksi-5-metil-4-izoksazolepropiyonik asit (AMPA) ve γ-aminobütirik asit (GABA) reseptörlerinin tutarlı ve güvenilir yanıtlarını elde etmek için metodolojik stratejinin yanı sıra normalizasyon ve titiz veri analizi için kullanılan yeni ayrıntılı yöntemler sunmaktadır.
Nörodejeneratif bozukluklar nüfusun büyük bir yüzdesini etkiler. Yıkıcı sonuçları iyi bilinmesine rağmen, beyin fonksiyonu için kritik olan nörotransmitter reseptörlerinin fonksiyonel değişiklikleri ile semptomatolojileri arasındaki bağlantı hala tam olarak anlaşılamamıştır. Bireyler arası değişkenlik, hastalığın kronik doğası ve semptomların sinsi başlangıcı, kimyasal dengesizliklerin iyi belgelendiği birçok beyin bozukluğunun anlaşılmasını geciktiren nedenlerden sadece birkaçıdır 1,2. Hayvan modelleri, evrimsel korunmuş sistemlerde fizyoloji ve patofizyolojinin altında yatan mekanizmalar hakkında paha biçilmez bilgiler üretmiş ve bilgimizi genişletmiştir; Bununla birlikte, kemirgenler ve insanlar arasındaki çeşitli türler arası farklılıklar, hayvan modellerinden insan beynine reseptör fonksiyonunun doğrudan ekstrapolasyonunu engellemektedir3. Bu nedenle, yerli insan reseptörlerini incelemek için ilk çabalar, Ricardo Miledi’nin laboratuvarı tarafından cerrahi olarak çıkarılmış doku ve dondurulmuş örnekler kullanılarak geliştirilmiştir. Bu ilk deneylerde, nöronal sinaptik ve ekstra sinaptik reseptörlerin yanı sıra nöronal olmayan nörotransmitter reseptörlerini içeren tüm membranlar kullanılmıştır ve hastalıklı durumlar hakkında önemli bilgiler sağlamalarına rağmen, reseptörlerin karışımınınverilerin yorumlanmasını zorlaştırdığı endişesi vardır 4,5,6,7. Daha da önemlisi, sinapslar birçok nörodejeneratif bozuklukta ana hedeftir 8,9; Bu nedenle, etkilenen sinapsların fonksiyonel özelliklerini test etmek için yapılan testler, sinaptik iletişimi etkileyen hastalıkla ilgili değişiklikler hakkında bilgi edinmek için esastır. Burada, orijinal yöntemin bir modifikasyonu açıklanmaktadır: zenginleştirilmiş sinaptik protein preparatlarının fizyolojik karakterizasyonuna odaklanan ve sıçan ve insan sinaptozomlarını incelemek için başarıyla uygulanan sinaptik membranların mikrotransplantasyonu (MSM) 10,11,12,13,14,15 . Bu metodolojiyle, bir zamanlar insan beyninde çalışan, kendi doğal lipitlerine gömülü sinaptik reseptörleri ve kendi ilişkili protein kohortlarıyla nakletmek mümkündür. Ayrıca, MSM verileri nicel olduğundan, bu verileri büyük proteomik veya sıralama veri kümeleriyle tümleştirmek için kullanmak mümkündür10.
Sinaptik reseptörlerin birçok farmakolojik ve biyofiziksel analizinin rekombinant proteinler üzerinde yapıldığını belirtmek önemlidir16,17. Bu yaklaşım, reseptörlerin yapı-fonksiyon ilişkileri hakkında daha iyi bir fikir verirken, nöronlarda bulunan karmaşık multimerik reseptör kompleksleri ve bunların hastalıktaki değişiklikleri hakkında bilgi sağlayamaz. Bu nedenle, doğal ve rekombinant proteinlerin bir kombinasyonu, sinaptik reseptörlerin daha kapsamlı bir analizini sağlamalıdır.
Bir laboratuvarın gereksinimlerine göre ayarlanabilen10,11,12,13,14,15 sinaptozomlarını hazırlamak için birçok yöntem vardır. Protokol, sinaptozomal zenginleştirilmiş preparatların izole edildiği ve mikrotransplantasyon deneyleri için işlenmeye hazır olduğu varsayımıyla başlar. Laboratuvarda, üretici talimatlarını izleyerek Syn-Per yöntemi kullanılır. Bu, elektrofizyolojik deneylerde yüksek tekrarlanabilirlik nedeniyle yapılır10,11. Ayrıca, enjeksiyon20 için hazır olarak satın alınabilen Xenopus oositleri 18,19’un nasıl izole edileceğini açıklayan çok sayıda literatür vardır.
Beyin bozukluklarında homeostatik ve patolojik süreçleri anlamak ve hastalıkları önlemek veya tedavi etmek için terapötik stratejiler geliştirmek için insan beyninden doğal protein komplekslerinin analizi gereklidir. Bu nedenle, çıtçıtlı dondurulmuş örnekler içeren beyin bankaları, büyük ve çoğunlukla kullanılmayan fizyolojik bilgi zenginliğinin paha biçilmez bir kaynağıdır29,30. Postmortem dokuyu kullanmak için ilk endişe, veriler…
The authors have nothing to disclose.
Bu çalışma, AL’ye NIA/NIH hibeleri R01AG070255 ve R01AG073133 tarafından desteklenmiştir. Ayrıca, bu makalede gösterilen insan dokusunu sağladığı için California Üniversitesi Irvine Alzheimer hastalığı araştırma merkezine (UCI-ADRC) teşekkür ederiz. UCI-ADRC, NIH / NIA hibesi P30 AG066519 tarafından finanse edilmektedir.
For Microinjection | |||
3.5" Glass Capillaries | Drummond | 3-000-203-G/X | |
24 well, flat bottom Tissue Culture Plate | Thermofisher | FB012929 | |
Flaming/Brown type micropipette puller | Sutter | P-1000 | |
Injection Dish | Thermofisher | 08-772B | |
Microcentrifuge Tubes | Thermofisher | 02-682-002 | |
Mineral Oil | Thermofisher | O121-1 | |
Nanoject II | Drummond | 3-000-204 | |
Nylon mesh | Industrial Netting | WN0800 | |
Parafilm | Thermofisher | S37440 | |
Stereoscope | Fisher Scientific | 03-000-037 | |
Syringe | Thermofisher | 14-841-31 | |
Ultrasonic cleaning bath | Thermofisher | FS20D | |
Xenopus laevis frogs | Xenopus 1 | 4217 | |
For Two Electrode Voltage clamp | |||
15 cm long fire polished borosilicate glass capillaries | Sutter | B200-116-15 | |
Any PC computer or laptop | |||
Low-pass Bessel Filter | Warner Instruments | LPF-8 | |
Stereoscope | Fisher Scientific | 03-000-037 | |
Two electrode voltage clamp workstation | Warner Instruments | TEV-700 | |
ValveLink 8.2 Perfusion Controller | Automate Scientific | SKU:01-18 | |
WInEDR Free software | University of Strathclyde Glasgow | https://spider.science.strath.ac.uk/sipbs/software_ses.htm | |
X Series Multifunction DAQ | National Instruments | NI USB-6341 | |
Reagents | |||
Calcium dichloride | Thermofisher | C79 | |
Calcium nitrate tetrahydrate | Thermofisher | C109 | |
Collagenase | Sigma-Aldrich | C0130 | |
GABA | Sigma-Aldrich | A2129 | |
HEPES (4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid) | Thermofisher | BP310 | |
Kainic acid | Tocris | 0222 | |
Magnesium sulfate heptahydrate | Thermofisher | M63 | |
Potassium chloride | Thermofisher | P217 | |
Sodium bicarbonate | Thermofisher | S233 | |
Sodium chloride | Thermofisher | S271-1 | |
Ultrafree-0.1 µm MC filter, | Amicon |