Microtrapianto di membrane sinaptiche per riattivare i recettori sinaptici umani per studi funzionali
Summary
Il protocollo dimostra che eseguendo il microtrapianto di membrane sinaptiche negli ovociti di Xenopus laevis, è possibile registrare risposte coerenti e affidabili dei recettori dell’acido α-ammino-3-idrossi-5-metil-4-isossazolepropionico e dell’acido γ-aminobutirrico.
Abstract
I recettori ionotropici eccitatori e inibitori sono le principali porte dei flussi ionici che determinano l’attività delle sinapsi durante la fisiologica comunicazione neuronale. Pertanto, alterazioni nella loro abbondanza, funzione e relazioni con altri elementi sinaptici sono state osservate come un importante correlato di alterazioni nella funzione cerebrale e deterioramento cognitivo nelle malattie neurodegenerative e nei disturbi mentali. Comprendere come la funzione dei recettori sinaptici eccitatori e inibitori sia alterata dalla malattia è di fondamentale importanza per lo sviluppo di terapie efficaci. Per ottenere informazioni rilevanti per la malattia, è importante registrare l’attività elettrica dei recettori dei neurotrasmettitori che rimangono funzionali nel cervello umano malato. Finora questo è l’approccio più vicino per valutare le alterazioni patologiche nella funzione dei recettori. In questo lavoro, viene presentata una metodologia per eseguire il microtrapianto di membrane sinaptiche, che consiste nel riattivare le membrane sinaptiche dal tessuto cerebrale umano congelato a scatto contenente recettori umani, mediante la sua iniezione e fusione posteriore nella membrana degli ovociti di Xenopus laevis . Il protocollo fornisce anche la strategia metodologica per ottenere risposte coerenti e affidabili dei recettori dell’acido α-ammino-3-idrossi-5-metil-4-isossazolepropionico (AMPA) e dell’acido γ-aminobutirrico (GABA), nonché nuovi metodi dettagliati che vengono utilizzati per la normalizzazione e l’analisi rigorosa dei dati.
Introduction
Le malattie neurodegenerative colpiscono una grande percentuale della popolazione. Sebbene le loro conseguenze devastanti siano ben note, il legame tra le alterazioni funzionali dei recettori dei neurotrasmettitori, che sono fondamentali per la funzione cerebrale, e la loro sintomatologia è ancora poco compreso. Variabilità interindividuale, natura cronica della malattia e insorgenza insidiosa dei sintomi sono solo alcuni dei motivi che hanno ritardato la comprensione dei numerosi disturbi cerebrali in cui gli squilibri chimici sono ben documentati 1,2. I modelli animali hanno generato informazioni preziose e ampliato le nostre conoscenze sui meccanismi alla base della fisiologia e della fisiopatologia nei sistemi evolutivi conservati; tuttavia, diverse differenze interspecie tra roditori e umani precludono l’estrapolazione diretta della funzione del recettore da modelli animali al cervello umano3. Pertanto, gli sforzi iniziali per studiare i recettori umani nativi sono stati sviluppati dal laboratorio di Ricardo Miledi utilizzando tessuto rimosso chirurgicamente e campioni congelati. Questi esperimenti iniziali hanno utilizzato intere membrane che includono recettori sinaptici neuronali e extra sinaptici e recettori neurotrasmettitori non neuronali e, sebbene forniscano importanti informazioni sugli stati patologici, c’è la preoccupazione che il mix di recettori complichi l’interpretazione dei dati 4,5,6,7. È importante sottolineare che le sinapsi sono l’obiettivo principale in molti disturbi neurodegenerativi 8,9; pertanto, i saggi per testare le proprietà funzionali delle sinapsi colpite sono fondamentali per ottenere informazioni sui cambiamenti rilevanti per la malattia che influenzano la comunicazione sinaptica. Qui viene descritta una modifica del metodo originale: microtrapianto di membrane sinaptiche (MSM), che si concentra sulla caratterizzazione fisiologica di preparati proteici sinaptici arricchiti ed è stato applicato con successo per studiare sinaptosomi di ratto e umani 10,11,12,13,14,15 . Con questa metodologia, è possibile trapiantare recettori sinaptici che una volta lavoravano nel cervello umano, incorporati nei propri lipidi nativi e con la propria coorte di proteine associate. Inoltre, poiché i dati MSM sono quantitativi, è possibile utilizzare questi dati per integrarsi con grandi set di dati proteomici o di sequenziamento10.
È importante notare che molte analisi farmacologiche e biofisiche dei recettori sinaptici sono fatte su proteine ricombinanti16,17. Mentre questo approccio fornisce una migliore comprensione delle relazioni struttura-funzione dei recettori, non può fornire informazioni sui complessi complessi di recettori multimerici trovati nei neuroni e sui loro cambiamenti nella malattia. Pertanto, una combinazione di proteine native e ricombinanti dovrebbe fornire un’analisi più completa dei recettori sinaptici.
Esistono molti metodi per preparare i sinaptosomi 10,11,12,13,14,15 che possono essere regolati per le esigenze di un laboratorio. Il protocollo inizia con il presupposto che i preparati arricchiti sinaptosomiali sono stati isolati e sono pronti per essere elaborati per esperimenti di microtrapianto. In laboratorio, il metodo Syn-Per viene utilizzato seguendo le istruzioni del produttore. Questo viene fatto a causa dell’elevata riproducibilità negli esperimenti elettrofisiologici10,11. C’è anche un’abbondante letteratura che spiega come isolare gli ovociti Xenopus 18,19, che possono anche essere acquistati pronti per l’iniezione20.
Protocol
Representative Results
Discussion
L’analisi dei complessi proteici nativi del cervello umano è necessaria per comprendere i processi omeostatici e patologici nei disturbi cerebrali e sviluppare strategie terapeutiche per prevenire o curare le malattie. Pertanto, le banche del cervello contenenti campioni congelati a scatto sono una fonte inestimabile di una grande e per lo più non sfruttata ricchezza di informazioni fisiologiche29,30. Una preoccupazione iniziale per l’uso del tessuto post-morte…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato supportato dalle sovvenzioni NIA/NIH R01AG070255 e R01AG073133 ad AL. Ringraziamo anche il centro di ricerca sulla malattia di Alzheimer dell’Università della California Irvine (UCI-ADRC) per aver fornito il tessuto umano mostrato in questo manoscritto. L’UCI-ADRC è finanziato dalla sovvenzione NIH/NIA P30 AG066519.
Materials
| For Microinjection | |||
| 3.5" Glass Capillaries | Drummond | 3-000-203-G/X | |
| 24 well, flat bottom Tissue Culture Plate | Thermofisher | FB012929 | |
| Flaming/Brown type micropipette puller | Sutter | P-1000 | |
| Injection Dish | Thermofisher | 08-772B | |
| Microcentrifuge Tubes | Thermofisher | 02-682-002 | |
| Mineral Oil | Thermofisher | O121-1 | |
| Nanoject II | Drummond | 3-000-204 | |
| Nylon mesh | Industrial Netting | WN0800 | |
| Parafilm | Thermofisher | S37440 | |
| Stereoscope | Fisher Scientific | 03-000-037 | |
| Syringe | Thermofisher | 14-841-31 | |
| Ultrasonic cleaning bath | Thermofisher | FS20D | |
| Xenopus laevis frogs | Xenopus 1 | 4217 | |
| For Two Electrode Voltage clamp | |||
| 15 cm long fire polished borosilicate glass capillaries | Sutter | B200-116-15 | |
| Any PC computer or laptop | |||
| Low-pass Bessel Filter | Warner Instruments | LPF-8 | |
| Stereoscope | Fisher Scientific | 03-000-037 | |
| Two electrode voltage clamp workstation | Warner Instruments | TEV-700 | |
| ValveLink 8.2 Perfusion Controller | Automate Scientific | SKU:01-18 | |
| WInEDR Free software | University of Strathclyde Glasgow | https://spider.science.strath.ac.uk/sipbs/software_ses.htm | |
| X Series Multifunction DAQ | National Instruments | NI USB-6341 | |
| Reagents | |||
| Calcium dichloride | Thermofisher | C79 | |
| Calcium nitrate tetrahydrate | Thermofisher | C109 | |
| Collagenase | Sigma-Aldrich | C0130 | |
| GABA | Sigma-Aldrich | A2129 | |
| HEPES (4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid) | Thermofisher | BP310 | |
| Kainic acid | Tocris | 0222 | |
| Magnesium sulfate heptahydrate | Thermofisher | M63 | |
| Potassium chloride | Thermofisher | P217 | |
| Sodium bicarbonate | Thermofisher | S233 | |
| Sodium chloride | Thermofisher | S271-1 | |
| Ultrafree-0.1 µm MC filter, | Amicon |
Riferimenti
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