Evaluierung der Substratubiquitylierung mittels E3-Ubiquitin-Ligase in Säugetierzelllysaten
Summary
Wir bieten ein detailliertes Protokoll für einen Ubiquitylierungsassay eines spezifischen Substrats und einer E3-Ubiquitin-Ligase in Säugetierzellen. HEK293T-Zelllinien wurden zur Proteinüberexpression verwendet, das polyubiquitylierte Substrat wurde durch Immunpräzipitation von Zelllysaten gereinigt und in SDS-PAGE aufgelöst. Immunoblotting wurde verwendet, um diese posttranslationale Modifikation zu visualisieren.
Abstract
Ubiquitylierung ist eine posttranslationale Modifikation, die in eukaryotischen Zellen auftritt und für die Regulation mehrerer biologischer Signalwege, einschließlich Zellüberleben, -proliferation und -differenzierung, entscheidend ist. Es ist ein reversibler Prozess, der aus einer kovalenten Bindung von Ubiquitin an das Substrat durch eine Kaskadenreaktion von mindestens drei verschiedenen Enzymen besteht, die aus E1 (Ubiquitin-Aktivierungsenzym), E2 (Ubiquitin-konjugierendes Enzym) und E3 (Ubiquitin-Ligase-Enzym) bestehen. Der E3-Komplex spielt eine wichtige Rolle bei der Substraterkennung und Ubiquitylierung. Hier wird ein Protokoll zur Bewertung der Substratubiquitylierung in Säugetierzellen unter Verwendung einer vorübergehenden Co-Transfektion eines Plasmids, das für das ausgewählte Substrat, eine E3-Ubiquitin-Ligase und ein markiertes Ubiquitin kodiert, beschrieben. Vor der Lyse werden die transfizierten Zellen mit dem Proteasom-Inhibitor MG132 (Carbobenzoxy-leu-leu-leucinal) behandelt, um einen proteasomalen Substratabbau zu vermeiden. Darüber hinaus wird der Zellextrakt einer kleinräumigen Immunpräzipitation (IP) unterzogen, um das polyubiquitylierte Substrat für den anschließenden Nachweis durch Western Blotting (WB) unter Verwendung spezifischer Antikörper für den Ubiquitin-Tag zu reinigen. Daher wird ein konsistentes und unkompliziertes Protokoll für den Ubiquitylierungsassay in Säugetierzellen beschrieben, um Wissenschaftler bei der Behandlung der Ubiquitylierung spezifischer Substrate und E3-Ubiquitin-Ligasen zu unterstützen.
Introduction
Posttranslationale Modifikationen (PTMs) sind ein wichtiger Mechanismus für die Proteinregulation, die für die Zellhomöostase essentiell ist. Die Proteinubiquitylierung ist eine dynamische und komplizierte Modifikation, die eine Auswahl verschiedener Signale erzeugt, was zu mehreren zellulären Ergebnissen in eukaryotischen Organismen führt. Die Ubiquitylierung ist ein reversibler Prozess, der in der Anlagerung eines Ubiquitinproteins mit 76 Aminosäuren an das Substrat besteht und in einer enzymatischen Kaskade auftritt, die aus drei verschiedenen Reaktionen besteht1. Der erste Schritt ist durch eine Ubiquitin-Aktivierung gekennzeichnet, die von einer ATP-Hydrolyse abhängt, um ein hochenergetisches Thioester-verknüpftes Ubiquitin zwischen dem Ubiquitin-C-Terminus und dem im aktiven Zentrum des E1-Enzyms vorhandenen Cysteinrest zu bilden. Anschließend wird das Ubiquitin auf das E2-Enzym übertragen und bildet mit dem Ubiquitin einen Thioester-ähnlichen Komplex. Danach wird das Ubiquitin kovalent durch das E2 oder häufiger durch das E3-Enzym, das das Substrat 2,3 erkennt und mit ihm interagiert, kovalent an das Substratgebunden. Gelegentlich sind E4-Enzyme (Ubiquitin-Kettendehnungsfaktoren) notwendig, um den Multiubiquitin-Kettenaufbauzu fördern 3.
Ubiquitin hat sieben Lysinreste (K6, K11, K27, K29, K33, K48 und K63), was die Bildung von Polyubiquitinketten ermöglicht, die unterschiedliche Verbindungen erzeugen, um verschiedene dreidimensionale Strukturen zu erzeugen, die von mehreren Effektorproteinen erkannt werden 4,5. Daher ist die Art der Polyubiquitinkette, die in das Substrat eingeführt wird, für das Schicksal seiner Zelleunerlässlich 6,7,8. Darüber hinaus könnte das Substrat auch durch seine N-terminalen Reste, die N-Degrons genannt werden, ubiquitiniert werden. Spezifische E3-Ubiquitin-Ligasen sind für die N-Degron-Erkennung verantwortlich und ermöglichen die Polyubiquitylierung des nahegelegenen Lysinrests9.
Heute sind mehr als 40 verschiedene SCF-spezifische Substrate charakterisiert. Unter diesen können wichtige Regulatoren mehrerer biologischer Signalwege, einschließlich Zelldifferenzierung und -entwicklung sowie Zellüberleben und -tod, gefunden werden10,11,12,13. Daher ist die Identifizierung spezifischer Substrate jeder E3-Ubiquitin-Ligase unerlässlich, um eine umfassende Karte verschiedener biologischer Ereignisse zu entwerfen. Auch wenn die Identifizierung echter Substrate biochemisch eine Herausforderung darstellt, ist der Einsatz biochemisch basierter Methoden sehr gut geeignet, um die Kettenspezifität und die Unterscheidung zwischen Mono- und Polyubiquitylierungzu bewerten 14. Diese Studie beschreibt ein vollständiges Protokoll für den Ubiquitylierungsassay unter Verwendung der Säugetierzelllinie HEK293T, die das Substrat UXT-V2 (Ubiquitously exprimierten Prefoldin-like Chaperon-Isoform 2) mit dem E3-Ubiquitin-Ligase-Komplex SCF (Fbxo7) überexprimiert. UXT-V2 ist ein essentieller Co-Faktor für die NF-κB-Signalgebung, und sobald dieses Protein in Zellen niedergeschlagen wird, hemmt es die TNF-α-induzierte NF-κB-Aktivierung11. So wird zum Nachweis von polyubiquityliertem UXT-V2 der Proteasom-Inhibitor MG132 verwendet, da er die Fähigkeit hat, die proteolytische Aktivität der 26S-Untereinheit des Proteasom-Komplexes15 zu blockieren. Darüber hinaus wird der Zellextrakt einem kleinen IP zur Reinigung des Substrats unterzogen, wobei ein spezifischer Antikörper verwendet wird, der zu Agaroseharz immobilisiert ist, um anschließend von WB unter Verwendung ausgewählter Antikörper nachgewiesen zu werden. Dieses Protokoll ist sehr nützlich, um die Substratubiquitylierung in der zellulären Umgebung zu validieren, und es kann auch für verschiedene Arten von Säugetierzellen und anderen E3-Ubiquitin-Ligase-Komplexen angepasst werden. Es ist jedoch notwendig, das getestete Substrat auch durch einen In-vitro-Ubiquitylierungsassay zu validieren, da sich beide Protokolle hinsichtlich der Identifizierung echter Substrate ergänzen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die Ubiquitylierung ist eine essentielle posttranslationale Modifikation, die die Spiegel mehrerer Proteine reguliert und eine entscheidende Rolle in vielen Signalwegen und biologischen Prozessen spielt, um eine gesunde intrazelluläre Umgebung zu gewährleisten. Das Ubiquitin-Proteasom-System (UPS) ist einer der Schwerpunkte der neueren pharmazeutischen Forschung und bietet die Möglichkeit, Tumorsuppressoren zu stabilisieren oder den Abbau onkogener Produkte zu induzieren22. Zum Beispiel förder…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
F.R.T wird von der FAPESP-Fördernummer 2020/15771-6 und der CNPq Universal 405836/2018-0 unterstützt. P.M.S.P und V.S werden von CAPES unterstützt. C.R.S.T.B.C wurde durch die FAPESP-Stipendiennummer 2019/23466-1 unterstützt. Wir danken Sandra R. C. Maruyama (FAPESP 2016/20258-0) für die materielle Unterstützung.
Materials
| 1.5 mL microtube | Axygen | PMI110-06A | |
| 100 mm TC-treated culture dish | Corning | 430167 | |
| 15 mL tube | Corning | 430766 | |
| 96-well plate | Cralplast | 655111 | |
| Agarose-anti-HA beads | Sigma-Aldrich | E6779 | |
| Anti Mouse antibody | Seracare | 5220-0341 | Goat anti-Mouse IgG |
| Anti Rabbit antibody | Seracare | 5220-0337 | Goat anti-Rabbit IgG |
| Anti-Actin antibody | Sigma-Aldrich | A3853 | Dilution used: 1:2000 |
| Anti-Fbxo7 antibody | Sigma-Aldrich | SAB1407251 | Dilution used: 1:1000 |
| Anti-HA antibody | Sigma-Aldrich | H3663 | Dilution used: 1:1000 |
| Anti-Myc antibody | Cell Signalling | 2272 | Dilution used: 1:1000 |
| Bradford reagent | Sigma-Aldrich | B6916-500ML | |
| BSA | Sigma-Aldrich | A9647-100G | Bovine Serum Albumin |
| Cell incubator | Nuaire | NU-4850 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5804R | 500 x g for 5 min |
| ChemiDoc | BioRad | ||
| Digital pH meter | Kasvi | K39-2014B | |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium | Corning | 10-017-CRV | High glucose |
| Fetal bovine serum | Gibco | F4135 | Filtrate prior use |
| HA peptide | Sigma-Aldrich | I2149 | |
| HEK293T cells | ATCC | CRL-3216 | |
| Hepes | Gibco | 15630080 | |
| KCl | VWR Life Science | 0365-500G | |
| Kline rotator | Global Trade Technology | GT-2OIBD | |
| MG-132 | Boston Biochem | I-130 | |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 5418R | |
| Na3VO4 (Ortovanadato) | |||
| NaF | |||
| Nitrocellulose blotting membrane | GE Healthcare | 10600016 | |
| NP40 (IGEPAL CA-630) | Sigma-Aldrich | I8896-100ML | |
| Optical microscope | OPTIKA microscopes | SN510768 | |
| Opti-MEM | Gibco | 31985-070 | |
| pcDNA3 | Invitrogen | V79020 | For mammalian expression |
| pcDNA3-2xFlag-Fbxo7 | Kindly donated by Dr. Marcelo Damário | Tag 2xFlag (N-terminal). Restriction enzymes: EcoRI and XhoI | |
| pcDNA3-2xFlag-Fbxo7-ΔF-box | Kindly donated by Dr. Marcelo Damário | Tag 2xFlag (N-terminal). Restriction enzymes: EcoRI and XhoI. Δ335-367 | |
| pcDNA3-UXTV2-HA | Kindly donated by Dr. Marcelo Damário | Tag HA (C-terminal). Restriction enzymes: EcoRI and XhoI | |
| pCMV-6xHis-Myc-Ubiquitin | Kindly donated by Dr. Marcelo Damário | Tag 6x-His-Myc (N-terminal). Restriction enzymes: EcoRI and KpnI | |
| Pen Strep Glutamine 100x | Gibco | 10378-016 | |
| Phosphate buffered saline 10x | AccuGENE | 51226 | To obtain a 1x PBS, dilute the 10x PBS into ultrapure water |
| Polyethylenimine (PEI) | Sigma-Aldrich | 9002-98-6 | |
| Ponceau S | VWR Life Science | 0860-50G | |
| Protease inhibitor cocktail SIGMAFAST | Sigma-Aldrich | S8820 | |
| Rocking Shaker | Kasvi | 19010005 | |
| SDS-PAGE system | BioRad | 165-8004 | |
| Solution Homogenizer | Phoenix Luferco | AP-22 | |
| Trizma base | Sigma-Aldrich | T6066-500G | |
| Trypsine (TrypLe Express) | Gibco | 12605-028 | |
| Western Blotting Luminol Reagent | Santa Cruz Biotechnology | SC-2048 |
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