Summary

Évaluation de l’ubiquitylation du substrat par l’ubiquitine-ligase E3 dans les lysats de cellules de mammifères

Published: May 10, 2022
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Summary

Nous fournissons un protocole détaillé pour un test d’ubiquitylation d’un substrat spécifique et d’une ubiquitine-ligase E3 dans des cellules de mammifères. Les lignées cellulaires HEK293T ont été utilisées pour la surexpression des protéines, le substrat polyubiquitylé a été purifié des lysats cellulaires par immunoprécipitation et résolu dans SDS-PAGE. L’immunoblotting a été utilisé pour visualiser cette modification post-traductionnelle.

Abstract

L’ubiquitylation est une modification post-traductionnelle qui se produit dans les cellules eucaryotes et qui est essentielle à la régulation de plusieurs voies biologiques, y compris la survie, la prolifération et la différenciation cellulaires. Il s’agit d’un processus réversible qui consiste en une fixation covalente de l’ubiquitine au substrat par une réaction en cascade d’au moins trois enzymes différentes, composées de E1 (enzyme d’activation de l’ubiquitine), E2 (enzyme conjuguant l’ubiquitine) et E3 (enzyme ubiquitine-ligase). Le complexe E3 joue un rôle important dans la reconnaissance et l’ubiquitylation du substrat. Ici, un protocole est décrit pour évaluer l’ubiquitylation du substrat dans les cellules de mammifères en utilisant la co-transfection transitoire d’un plasmide codant pour le substrat sélectionné, une ligase d’ubiquitine E3 et une ubiquitine marquée. Avant la lyse, les cellules transfectées sont traitées avec l’inhibiteur du protéasome MG132 (carbobenzoxy-leu-leu-leucinal) pour éviter la dégradation protéasomique du substrat. En outre, l’extrait cellulaire est soumis à une immunoprécipitation (IP) à petite échelle pour purifier le substrat polyubiquitylé en vue d’une détection ultérieure par transfert western (WB) à l’aide d’anticorps spécifiques pour l’étiquette ubiquitine. Par conséquent, un protocole cohérent et simple pour le dosage de l’ubiquitylation dans les cellules de mammifères est décrit pour aider les scientifiques à traiter l’ubiquitylation de substrats spécifiques et les ligas d’ubiquitine E3.

Introduction

Les modifications post-traductionnelles (PTM) sont un mécanisme important concernant la régulation des protéines, qui est essentielle pour l’homéostasie cellulaire. L’ubiquitylation des protéines est une modification dynamique et complexe qui crée un assortiment de différents signaux entraînant plusieurs résultats cellulaires chez les organismes eucaryotes. L’ubiquitylation est un processus réversible consistant en la fixation d’une protéine d’ubiquitine contenant 76 acides aminés au substrat, se produisant dans une cascade enzymatique composée de trois réactions distinctes1. La première étape est caractérisée par l’activation de l’ubiquitine, qui dépend d’une hydrolyse de l’ATP pour former une ubiquitine liée au thioester de haute énergie entre l’ubiquitine C-terminus et le résidu de cystéine présent dans le site actif de l’enzyme E1. Par la suite, l’ubiquitine est transférée à l’enzyme E2 formant un complexe semblable à un thioester avec l’ubiquitine. Par la suite, l’ubiquitine est fixée de manière covalente au substrat par l’E2, ou plus souvent, par l’enzyme E3, qui reconnaît et interagit avec le substrat 2,3. Parfois, des enzymes E4 (facteurs d’allongement de la chaîne ubiquitine) sont nécessaires pour favoriser l’assemblage de la chaîne multiubiquitine3.

L’ubiquitine a sept résidus de lysine (K6, K11, K27, K29, K33, K48 et K63), permettant la formation de chaînes de polyubiquitine qui génèrent des liaisons distinctes pour produire différentes structures tridimensionnelles qui vont être reconnues par plusieurs protéines effectrices 4,5. Par conséquent, le type de chaîne de polyubiquitine introduit dans le substrat est essentiel pour décider de son devenir cellulaire 6,7,8. De plus, le substrat pourrait également être ubiquitiné par ses résidus N-terminaux appelés N-dégrons. Les ubiquitine-ligases E3 spécifiques sont responsables de la reconnaissance du N-degron, permettant la polyubiquitylation du résidu de lysine9 à proximité.

De nos jours, il existe plus de 40 substrats différents spécifiques au SCF caractérisés. Parmi ceux-ci, les principaux régulateurs de plusieurs voies biologiques, y compris la différenciation et le développementcellulaires ainsi que la survie et la mort cellulaires, peuvent être trouvés 10,11,12,13. Ainsi, l’identification de substrats spécifiques de chaque ubiquitine-ligase E3 est essentielle pour concevoir une carte complète des différents événements biologiques. Même si l’identification de véritables substrats est biochimiquement difficile, l’utilisation de méthodes basées sur la biochimie est très appropriée pour évaluer la spécificité de la chaîne et la distinction entre mono- et polyubiquitylation14. Cette étude décrit un protocole complet pour le dosage de l’ubiquitylation utilisant la lignée cellulaire de mammifères HEK293T surexprimant le substrat UXT-V2 (Ubiquitously expressed prefoldin-like chaperone isoform 2) avec le complexe E3 ubiquitine-ligase SCF (Fbxo7). L’UXT-V2 est un cofacteur essentiel pour la signalisation NF-κB, et une fois que cette protéine est renversée dans les cellules, elle inhibe l’activation NF-κB induite par le TNF-α11. Ainsi, pour détecter l’UXT-V2 polyubiquitylé, l’inhibiteur du protéasome MG132 est utilisé puisqu’il a la capacité de bloquer l’activité protéolytique de la sous-unité 26S du complexe protéasome15. En outre, l’extrait cellulaire est soumis à une IP à petite échelle pour purifier le substrat, en utilisant un anticorps spécifique immobilisé en résine d’agarose pour une détection ultérieure par WB à l’aide d’anticorps sélectionnés. Ce protocole est très utile pour valider l’ubiquitylation du substrat dans l’environnement cellulaire, et il peut également être adapté à différents types de cellules de mammifères et à d’autres complexes E3 ubiquitine-ligase. Cependant, il est nécessaire de valider le substrat testé par un test d’ubiquitylation in vitro, car les deux protocoles se complètent en ce qui concerne l’identification de véritables substrats.

Protocol

REMARQUE : La figure 1 présente un aperçu du protocole de dosage de l’ubiquitylation dans les cellules de mammifères. Graphique 1. Vue d’ensemble de la procédure de dosage de l’ubiquitylation. …

Representative Results

L’UXT (transcription exprimée de manière ubiquitaire) est une protéine de type préfoldine qui forme des complexes de repliement des protéines exprimés de manière omniprésente dans les tissus murins et humains tels que le cœur, le cerveau, les muscles squelettiques, le placenta, le pancréas, les reins et le foie18. Deux isoformes d’épissage d’UXT, nommées UXT-V1 et UXT-V2, ont été décrites comme remplissant des fonctions et des emplacements subcellulaires distincts. L’UXT-V1 …

Discussion

L’ubiquitylation est une modification post-traductionnelle essentielle qui régule les niveaux de plusieurs protéines et joue un rôle crucial dans de nombreuses voies de signalisation et processus biologiques, assurant un environnement intracellulaire sain. Le système ubiquitine-protéasome (UPS) est l’un des principaux axes de la recherche pharmaceutique récente, offrant la possibilité de stabiliser les suppresseurs de tumeurs ou d’induire la dégradation des produits oncogènes22. Par…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

F.R.T est soutenu par le numéro de subvention FAPESP 2020/15771-6 et CNPq Universal 405836/2018-0. P.M.S.P et V.S sont soutenus par CAPES. C.R.S.T.B.C a été soutenu par la bourse FAPESP numéro 2019/23466-1. Nous remercions Sandra R. C. Maruyama (FAPESP 2016/20258-0) pour son soutien matériel.

Materials

1.5 mL microtube Axygen PMI110-06A
100 mm TC-treated culture dish Corning 430167
15 mL tube Corning 430766
96-well plate Cralplast 655111
Agarose-anti-HA beads Sigma-Aldrich E6779
Anti Mouse antibody Seracare 5220-0341 Goat anti-Mouse IgG
Anti Rabbit antibody Seracare 5220-0337 Goat anti-Rabbit IgG
Anti-Actin antibody Sigma-Aldrich A3853 Dilution used: 1:2000
Anti-Fbxo7 antibody Sigma-Aldrich SAB1407251 Dilution used: 1:1000
Anti-HA antibody Sigma-Aldrich H3663 Dilution used: 1:1000
Anti-Myc antibody Cell Signalling 2272 Dilution used: 1:1000
Bradford reagent Sigma-Aldrich B6916-500ML
BSA Sigma-Aldrich A9647-100G Bovine Serum Albumin
Cell incubator Nuaire NU-4850
Centrifuge Eppendorf 5804R 500 x g for 5 min
ChemiDoc BioRad
Digital pH meter Kasvi K39-2014B
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium Corning 10-017-CRV High glucose
Fetal bovine serum Gibco F4135 Filtrate prior use
HA peptide Sigma-Aldrich I2149
HEK293T cells ATCC CRL-3216
Hepes Gibco 15630080
KCl VWR Life Science 0365-500G
Kline rotator Global Trade Technology GT-2OIBD
MG-132 Boston Biochem I-130
Microcentrifuge Eppendorf 5418R
Na3VO4 (Ortovanadato)
NaF
Nitrocellulose blotting membrane GE Healthcare 10600016
NP40 (IGEPAL CA-630) Sigma-Aldrich I8896-100ML
Optical microscope OPTIKA microscopes SN510768
Opti-MEM Gibco 31985-070
pcDNA3 Invitrogen V79020 For mammalian expression
pcDNA3-2xFlag-Fbxo7  Kindly donated by Dr. Marcelo Damário Tag 2xFlag (N-terminal). Restriction enzymes: EcoRI and XhoI
pcDNA3-2xFlag-Fbxo7-ΔF-box  Kindly donated by Dr. Marcelo Damário Tag 2xFlag (N-terminal). Restriction enzymes: EcoRI and XhoI. Δ335-367
pcDNA3-UXTV2-HA  Kindly donated by Dr. Marcelo Damário Tag HA (C-terminal). Restriction enzymes: EcoRI and XhoI
pCMV-6xHis-Myc-Ubiquitin  Kindly donated by Dr. Marcelo Damário Tag 6x-His-Myc (N-terminal). Restriction enzymes: EcoRI and KpnI
Pen Strep Glutamine 100x Gibco 10378-016
Phosphate buffered saline 10x AccuGENE 51226 To obtain a 1x PBS, dilute the 10x PBS into ultrapure water
Polyethylenimine (PEI) Sigma-Aldrich 9002-98-6
Ponceau S VWR Life Science 0860-50G
Protease inhibitor cocktail SIGMAFAST Sigma-Aldrich S8820
Rocking Shaker Kasvi 19010005
SDS-PAGE system BioRad 165-8004
Solution Homogenizer Phoenix Luferco AP-22
Trizma base Sigma-Aldrich T6066-500G
Trypsine (TrypLe Express) Gibco 12605-028
Western Blotting Luminol Reagent Santa Cruz Biotechnology SC-2048

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Citazione di questo articolo
dos Passos, P. M. S., Spagnol, V., de Correia, C. R., Teixeira, F. R. Evaluation of Substrate Ubiquitylation by E3 Ubiquitin-ligase in Mammalian Cell Lysates. J. Vis. Exp. (183), e63561, doi:10.3791/63561 (2022).

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