Оценка убиквитилирования субстрата убиквитин-лигазой E3 в лизатах клеток млекопитающих

Посттрансляционные модификации (PTM) являются важным механизмом регуляции белка, который необходим для клеточного гомеостаза. Убиквитилирование белка представляет собой динамическую и сложную модификацию, которая создает набор различных сигналов, приводящих к нескольким клеточным результатам у эукариотических организмов. Убиквитилирование представляет собой обратимый процесс, заключающийся в прикреплении к субстрату белка убиквитина, содержащего 76 аминокислот, происходящий в ферментативном каскаде, состоящем из трех различных реакций¹. Первая стадия характеризуется активацией убиквитина, которая зависит от гидролиза АТФ с образованием высокоэнергетического тиоэфир-связанного убиквитина между Убиквитином С-концом и остатком цистеина, присутствующим в активном центре фермента Е1. Впоследствии убиквитин переносится на фермент Е2, образуя тиоэфироподобный комплекс с убиквитином. После этого убиквитин ковалентно присоединяется к субстрату Е2 или, чаще, ферментом Е3, который распознает субстрат ^2,3 и взаимодействует с ним. Иногда ферменты E4 (факторы удлинения убиквитиновой цепи) необходимы для стимулирования сборки мультиубиквитиновой цепи³.

Убиквитин имеет семь остатков лизина (K6, K11, K27, K29, K33, K48 и K63), что позволяет формировать полиубиквитиновые цепи, которые генерируют различные связи для получения различных трехмерных структур, которые будут распознаваться несколькими эффекторными белками ^4,5. Следовательно, вид полиубиквитиновой цепи, введенный в субстрат, необходим для решения его клеточной судьбы ^6,7,8. Кроме того, субстрат также может быть убиквитинирован через его N-концевые остатки, называемые N-дегронами. Специфические убиквитин-лигазы E3 отвечают за распознавание N-дегронов, что позволяет полиубиквитилировать близлежащий остаток лизина⁹.

В настоящее время существует более 40 различных субстратов, специфичных для SCF. Среди них ключевые регуляторы нескольких биологических путей, включая дифференцировку и развитие клеток, а также выживание и гибель клеток, можно найти 10,11,12,13. Таким образом, идентификация специфических субстратов каждой Е3 убиквитин-лигазы имеет важное значение для разработки всеобъемлющей карты различных биологических событий. Несмотря на то, что идентификация истинных субстратов является биохимически сложной задачей, использование методов, основанных на биохимии, очень подходит для оценки специфичности цепи и различия между моно- и полиубиквитилированием¹⁴. Это исследование описывает полный протокол анализа убиквитилирования с использованием клеточной линии млекопитающих HEK293T, сверхэкспрессирующей субстрат UXT-V2 (повсеместно экспрессируемый префолдиноподобный изоформа шаперона 2) с помощью E3 убиквитин-лигазного комплекса SCF (Fbxo7). UXT-V2 является важным кофактором для передачи сигналов NF-κB, и как только этот белок сбивается в клетках, он ингибирует активацию NF-κB, индуцированную TNF-α¹¹. Таким образом, для обнаружения полиубиквитилированного UXT-V2 используется ингибитор протеасомы MG132, поскольку он обладает способностью блокировать протеолитическую активность субъединицы 26S протеасомного комплекса¹⁵. Кроме того, клеточный экстракт подают на мелкомасштабный IP для очистки субстрата, используя специфическое антитело, иммобилизованное в агарозную смолу для последующего обнаружения WB с использованием выбранных антител. Этот протокол очень полезен для проверки убиквитилирования субстрата в клеточной среде, а также может быть адаптирован для различных типов клеток млекопитающих и других комплексов убиквитин-лигазы E3. Тем не менее, необходимо также проверить субстрат, протестированный с помощью анализа убиквитилирования in vitro, поскольку оба протокола дополняют друг друга в отношении идентификации истинных субстратов.