L’objectif de ce protocole est de diriger l’adhésion et la croissance des cellules vers des zones ciblées de grilles pour la cryo-microscopie électronique. Ceci est réalisé en appliquant une couche antisalissure qui est ablation dans des modèles spécifiés par l’utilisateur, suivie d’un dépôt de protéines de matrice extracellulaire dans les zones à motifs avant l’ensemencement cellulaire.
La cryo-tomographie électronique à cellules entières (cryo-ET) est une technologie puissante utilisée pour produire des structures de résolution nanométrique de macromolécules présentes dans le contexte cellulaire et conservées dans un état quasi natif congelé-hydraté. Cependant, il existe des défis associés à la culture et / ou à l’adhésion des cellules sur des grilles TEM d’une manière qui convient à la tomographie tout en maintenant les cellules dans leur état physiologique. Ici, un protocole détaillé étape par étape est présenté sur l’utilisation du micromodèlement pour diriger et promouvoir la croissance cellulaire eucaryote sur les grilles TEM. Au cours du micromodèlement, la croissance cellulaire est dirigée en déposant des protéines de matrice extracellulaire (ECM) dans des motifs et des positions spécifiés sur la feuille de la grille TEM tandis que les autres zones restent recouvertes d’une couche antisalissure. La flexibilité dans le choix du revêtement de surface et de la conception des motifs rend le micromodèlement largement applicable à un large éventail de types de cellules. Le micromodèlement est utile pour l’étude des structures au sein de cellules individuelles ainsi que pour des systèmes expérimentaux plus complexes tels que les interactions hôte-pathogène ou les communautés multicellulaires différenciées. Le micromodèlement peut également être intégré dans de nombreux flux de travail cryo-ET à cellules entières en aval, y compris la microscopie électronique et à lumière corrélative (cryo-CLEM) et le fraisage par faisceau d’ions focalisés (cryo-FIB).
Avec le développement, l’expansion et la polyvalence de la cryo-microscopie électronique (cryo-EM), les chercheurs ont examiné un large éventail d’échantillons biologiques dans un état quasi natif allant de la résolution macromoléculaire (~1 nm) à la résolution élevée (~2 Å). Les techniques de cryo-EM et de diffraction d’électrons à particule unique sont mieux appliquées aux macromolécules purifiées en solution ou à l’état cristallin, respectivement1,2. Alors que la cryo-tomographie électronique (cryo-ET) est particulièrement adaptée aux études structurelles et ultrastructurales quasi natives de grands objets hétérologues tels que des bactéries, des virus pléomorphes et des cellules eucaryotes3. En cryo-ET, l’information tridimensionnelle (3D) est obtenue en inclinant physiquement l’échantillon sur la scène du microscope et en acquérant une série d’images à travers l’échantillon sous différents angles. Ces images, ou séries d’inclinaison, couvrent souvent une plage de +60/-60 degrés par incréments d’un à trois degrés. La série d’inclinaison peut ensuite être reconstruite par calcul en un volume 3D, également appelé tomogramme4.
Toutes les techniques cryo-EM nécessitent que l’échantillon soit incorporé dans une fine couche de glace vitreuse amorphe, non cristalline. L’une des techniques de cryofixation les plus couramment utilisées est la congélation par immersion, où l’échantillon est appliqué sur la grille EM, effacé et rapidement plongé dans de l’éthane liquide ou un mélange d’éthane liquide et de propane. Cette technique est suffisante pour la vitrification d’échantillons de <100 nm à ~10 μm d’épaisseur, y compris les cellules humaines cultivées, telles que les cellules HeLa5,6. Des échantillons plus épais, tels que des mini-organoïdes ou des biopsies tissulaires, jusqu’à 200 μm d’épaisseur, peuvent être vitrifiés par congélation à haute pression7. Cependant, en raison de la diffusion accrue des électrons d’échantillons plus épais, l’épaisseur de l’échantillon et de la glace pour le cryo-ET est limitée à ~ 0,5 – 1 μm dans les microscopes électroniques à transmission de 300 kV. Par conséquent, la cryo-ET à cellules entières de nombreuses cellules eucaryotes est limitée à la périphérie cellulaire ou aux extensions des cellules, à moins que des étapes supplémentaires de préparation de l’échantillon ne soient utilisées, telles que la cryo-sectionnement8 ou le broyage par faisceau d’ions focalisés9,10,11.
Une limitation de nombreuses expériences d’imagerie cryo-ET à cellules entières est le débit de collecte de données12. Contrairement à la cryo-EM à particule unique, où des milliers de particules isolées peuvent souvent être imagées à partir d’un seul carré de grille TEM, les cellules sont grandes, étalées et doivent être cultivées à une densité suffisamment faible pour permettre aux cellules d’être préservées dans une fine couche de glace vitreuse. Souvent, la région d’intérêt est limitée à une caractéristique ou à une sous-zone particulière de la cellule. La propension des cellules à se développer sur des zones qui ne se prêtent pas à l’imagerie TEM, telles que sur ou à proximité des barres de grille TEM, limite encore plus le débit. En raison de facteurs imprévisibles associés à la culture cellulaire sur les réseaux TEM, des développements technologiques sont nécessaires pour améliorer l’accessibilité des échantillons et le débit pour l’acquisition de données.
Le micromodèlement de substrat avec des protéines de matrice extracellulaire adhérente (ECM) est une technique bien établie pour la microscopie optique à cellules vivantes pour diriger la croissance des cellules sur des surfaces rigides, durables et optiquement transparentes telles que le verre et d’autres substrats de culture tissulaire13,14. Le micromodèlement a également été effectué sur des surfaces souples et/ou tridimensionnelles (3D). De telles techniques n’ont pas seulement permis le positionnement précis des cellules; ils ont également soutenu la création de réseaux multicellulaires, tels que des circuits de cellules neurales à motifs15. L’introduction du micromodèlement dans le cryo-ET augmentera non seulement le débit, mais elle peut également ouvrir la voie à de nouvelles études pour explorer des microenvironnements cellulaires complexes et dynamiques.
Récemment, plusieurs groupes ont commencé à utiliser des techniques de micromodélisme sur des grilles TEM par le biais de multiples approches16,17. Ici, l’utilisation d’une technique de photomodèlement sans masque pour les grilles TEM est décrite à l’aide du système de micromotifs Alvéole PRIMO, qui présente des motifs haute résolution et sans contact. Avec ce système de micromodèlement, une couche antisalissure est appliquée sur le dessus du substrat, suivie de l’application d’un photocatalyseur et de l’ablation de la couche antisalissure dans des motifs définis par l’utilisateur avec un laser UV. Les protéines ECM peuvent ensuite être ajoutées aux modèles pour la culture cellulaire appropriée. Cette méthode a été utilisée par plusieurs groupes pour des études cryo-ET de pigments rétiniens épithéliaux-1 (RPE1), de reins canins Madin-Darby II (MDCKII), de fibroblastes du prépuce humain (HFF) et de lignées cellulaires endothéliales16,17,18. Ce système de micromodélisme est compatible avec plusieurs substrats de couche antisalissure ainsi qu’avec un réactif photocatalyseur liquide ou en gel. Une variété de protéines ECM peut être sélectionnée et adaptée à la spécificité de la lignée cellulaire, conférant une polyvalence à l’utilisateur.
Le micromodèlement a été appliqué avec succès à un certain nombre de projets au sein du laboratoire19. Ici, un protocole de micromodélisation est présenté, y compris des adaptations spécifiques pour étudier les cellules HeLa cultivées, les cellules BEAS-2B infectées par le virus respiratoire syncytial (VRS) et les neurones larvaires primaires de Drosophila melanogaster20.
Les microscopes électroniques et les progiciels modernes et avancés prennent désormais en charge la collecte automatisée de données cryo-EM et cryo-ET rationalisées où des centaines à des milliers de positions peuvent être ciblées et imagées en quelques jours32,33,34,35. Un facteur limitant important pour les flux de travail cryo-ET à cellules entières a été l’obtention d’un nombre suffisant de cibles collectables par grille. Récemment, un certain nombre de groupes ont développé des protocoles pour les grilles de micromoptulation pour la cryo-EM, l’un des avantages étant l’amélioration de l’efficacité de la collecte de données16,17,18. Ici, un protocole est présenté pour l’utilisation d’un système de micromoptrie disponible dans le commerce pour micromotifs tem grilles pour les études cryo-ET des neurones primaires de la drosophile et des lignées cellulaires humaines cultivées (non infectées ou infectées par le VRS). Ce système de micromodèlement est polyvalent et de nombreuses étapes peuvent être optimisées et adaptées pour répondre à des objectifs expérimentaux spécifiques. Un utilisateur ayant une expérience de la TEM et de la microscopie à fluorescence peut rapidement acquérir des compétences en préparation de grille et en micromodèlement. Avec une pratique minutieuse, de bons résultats devraient être réalisables après quelques itérations. Ci-dessous, certaines des options disponibles, les considérations de l’utilisateur, les avantages potentiels et les applications futures du micromodèle pour cryo-EM sont discutés.
L’une des considérations importantes pour la cryo-ET à cellules entières est la sélection de la grille EM. Les grilles EM sont composées de deux parties: un cadre en maille (ou support structurel) et la feuille (ou film), qui est la surface du film continu ou troué sur lequel les cellules vont se développer. Les grilles de mailles de cuivre sont couramment utilisées pour la cryo-EM de protéines et de complexes isolés. Cependant, ils ne conviennent pas à la cryo-ET à cellules entières en raison de la cytotoxicité du cuivre. Au lieu de cela, un maillage d’or est couramment utilisé pour la tomographie cellulaire. D’autres options incluent le nickel ou le titane, qui peuvent offrir des avantages par rapport à l’or, tels qu’une rigidité accrue16. Les grilles EM sont disponibles avec différentes dimensions de maillage pour prendre en charge une gamme d’applications. Des maillages plus grands offrent plus d’espace aux cellules pour se développer entre les barres de grille et plus de zones qui se prêtent à la collecte de séries d’inclinaison, mais au prix d’une fragilité globale accrue des spécimens. La feuille la plus couramment utilisée est le carbone amorphe perforé ou troué, tel que les Quantifoils ou les grilles C-flat. Les cibles biologiques peuvent être imagées soit à travers les trous dans le carbone, soit à travers le carbone translucide électronique. Les grilles telles que R 2/1 ou R 2/2, où les trous ont une largeur de 2 μm et sont espacés respectivement de 1 et 2 μm, fournissent un grand nombre de trous et donc un grand nombre de zones potentielles pour la collecte de données. Cependant, certaines cellules peuvent se développer et se développer mieux sur des surfaces plus uniformes telles que les grilles R 1.2/20 ou le carbone continu. Pour le traitement des échantillons en aval par broyage par faisceau d’ions focalisés (cryo-FIB), la feuille est retirée par fraisage, ce qui réduit les inquiétudes quant à la présence continue du film sous-jacent. Comme pour le maillage, des feuilles d’autres matériaux sont également disponibles, le protocole de motif présenté ici étant également adapté aux grilles SiO2 . Les grilles couramment utilisées comprennent le Quantifoil d’or, le carbone continu ou les grilles à 200 mailles à film SiO2 (espacement d’environ 90 μm entre les barres de grille) pour le cryo-ET à cellules entières.
Il existe un certain nombre de considérations lors de la conception d’un modèle. La majorité de ces décisions sont guidées par le type de cellule et le but de l’expérience. Un bon point de départ est de choisir un motif qui se rapproche de la forme et des dimensions des cellules en culture. De nombreuses études ont démontré des effets significatifs de la forme du motif sur la croissance cellulaire et l’arrangement du cytosquelette13,36,37. Une attention particulière doit être prise lors de la conception du modèle si cela pourrait modifier la cible d’intérêt. Plusieurs modèles pour chaque type de cellule ont été testés pour déterminer quels modèles favorisaient l’adhésion et la croissance cellulaires. La flexibilité du système de micromotilage permet de tester plusieurs modèles sur une seule grille et de modifier les modèles pour différentes grilles au sein d’une même expérience. Des motifs plus grands (~ 50-90 μm), tels que ceux utilisés ici, augmentent la probabilité que plusieurs cellules adhèrent à une seule région du motif et permettent aux cellules de se dilater et de s’étendre après l’adhésion. Des modèles plus contraints (20-30 μm) peuvent être appropriés dans les expériences où l’isolement cellulaire est plus critique que l’expansion cellulaire, comme pour les expériences de fraisage par faisceau d’ions focalisés (cryo-FIB). Pour les applications de tomographie, il peut être nécessaire de tenir compte de l’impact de l’axe d’inclinaison. Si un motif est positionné de telle sorte que toutes les cellules se développent parallèlement les unes aux autres dans une seule direction, il est possible que toutes les cellules soient perpendiculaires à l’axe d’inclinaison lorsqu’elles sont chargées sur l’étage du microscope, ce qui entraîne une qualité inférieure des données.
Sur les grilles non modélisées, les cellules adhèrent souvent préférentiellement aux barres de grille, où elles ne peuvent pas être imagées par TEM. Même sur les grilles à motifs, on observe souvent que les cellules sont positionnées dans les coins des carrés de grille partiellement sur la feuille de carbone à motifs et la barre de grille. Récemment, le micromodèlement a été utilisé pour positionner intentionnellement une partie de la cellule sur la barre de grille18. Cela pourrait être envisagé pour les expériences où il n’est pas essentiel d’avoir toute la périphérie de la cellule sur la feuille. Cela peut être particulièrement important pour les cellules qui peuvent devenir plus grandes qu’un seul carré de grille, comme les neurones primaires qui se développent sur plusieurs jours.
Il existe de nombreux outils qui peuvent être utilisés pour concevoir un motif. Ici, le motif a été limité à moins de 800 pixels dans n’importe quelle dimension, de sorte que le motif peut être tourné à n’importe quel angle tout en s’adaptant à la zone maximale pouvant être modelée en une seule projection par ce système de micromotifs. Cela permet à l’utilisateur de faire pivoter le motif pour qu’il soit correctement orienté avec la grille, quelle que soit l’orientation de la grille sur le microscope. Ici, la grille a été divisée en six zones de motifs. Principalement, cela permet l’ajustement de la mise au point entre différentes régions de la grille. Les grilles d’or, en particulier, sont très malléables et peuvent ne pas se poser complètement à plat sur le verre. Une bonne concentration est essentielle pour des résultats de motifs propres et raffinés. En utilisant des motifs segmentés, seuls des ajustements mineurs de la position du motif doivent être effectués si la grille se déplace légèrement pendant le processus de motif, bien que ce ne soit généralement pas un problème lors de l’utilisation du gel PLPP avec les pochoirs PDMS. Enfin, les quatre carrés centraux de la grille sont restés sans motif. Cela permet à un utilisateur d’identifier clairement le centre de la grille, ce qui est très utile pour les expériences d’imagerie corrélative.
Le logiciel de modélisation de ce système de micromotège, Leonardo, possède également des fonctionnalités plus avancées telles que l’assemblage et la possibilité d’importer des motifs au format PDF, qui dépassent le cadre de ce protocole. Ce logiciel comprend également la détection de microstructures et le positionnement automatisé des motifs qui peuvent être utilisés sur les grilles TEM. Cette fonctionnalité est particulièrement utile lorsque la grille est très plate et peut être modelée sans qu’il soit nécessaire d’ajuster la mise au point entre différentes zones.
La sélection d’une protéine ECM peut avoir un impact significatif sur l’adhésion et l’expansion cellulaires. Certaines cellules sont connues pour subir des changements physiologiques lorsqu’elles sont cultivées sur des substrats spécifiques38. Plusieurs protéines et concentrations ECM ont été testées pour tout nouveau type de cellule sur la base de travaux antérieurs rapportés dans la littérature. La laminine, le fibrinogène, la fibronectine et le collagène sont largement utilisés pour les cellules cultivées et peuvent être utilisés comme point de départ si d’autres données ne sont pas disponibles. Cependant, d’autres protéines ECM doivent également être envisagées si les protéines ECM couramment utilisées ne confèrent pas les propriétés d’adhérence appropriées aux cellules. Cela était particulièrement vrai pour les neurones primaires de la drosophile , car une forte concentration de la lectine végétale concanavaline A était nécessaire pour une bonne adhérence cellulaire. La compatibilité de l’adhésion et de la croissance cellulaires avec l’ECM peut être testée en modelant sur des plats en verre ou des lames avant la transition vers les grilles TEM. Cette approche de présélection est rapide et rentable si un grand nombre de combinaisons doivent être examinées. L’inclusion d’une protéine ECM conjuguée par fluorescence est précieuse pour évaluer le succès et la qualité du motif.
L’ensemencement cellulaire est l’une des étapes les plus importantes pour la cryo-ET de cellules entières, avec ou sans micromotif6,16,39. Pour la drosophile primaire ou d’autres neurones, qui sont fragiles, instables en suspension et peuvent être limités en quantité, les approches d’ensemencement unique sont préférées à l’ensemencement cellulaire séquentiel surveillé. Une seule étape d’ensemencement à une densité cellulaire optimisée, comme décrit dans le protocole pour les neurones de la drosophile, est une option viable pour la plupart des types de cellules. Cependant, il est également possible d’ensemencer des cellules sur le substrat à une concentration initiale plus faible et d’ajouter plus de cellules de manière surveillée, comme décrit ici et dans d’autres publications18. Cet ensemencement séquentiel peut fournir des résultats plus cohérents dans certains cas. Comme pour la culture cellulaire standard, il faut toujours veiller à maintenir la viabilité cellulaire et à minimiser l’agglutination cellulaire pendant l’isolement.
Lorsque vous commencez avec le micromodèlement, il y a quelques pièges potentiels qui nuisent au résultat final. Une manipulation minutieuse de la grille et une technique stérile, une distribution uniforme du gel PLPP, une dose et une concentration appropriées pendant le modelage et le maintien de la viabilité cellulaire avant l’ensemencement sont parmi les considérations les plus importantes pour le succès. Une liste de certains des problèmes potentiels ainsi que des solutions a été dressée dans le tableau 1.
Les grilles à micromotifs peuvent être utilisées pour aider à positionner les cellules afin d’établir une densité cellulaire cohérente sur l’ensemble de la grille et de positionner les régions d’intérêt dans des zones adaptées à la collecte de séries d’inclinaison16,18. Le placement et le positionnement des cellules peuvent être utilisés comme marqueurs fiducaux pour la corrélation dans les expériences cryo-CLEM, réduisant ainsi le besoin de grilles de recherche fragiles et de marqueurs fiducaux fluorescents. Cependant, il convient de noter que de tels marqueurs fiduciels peuvent encore être utiles pour la corrélation de précision inférieure au micromètre29,40. En outre, une distribution uniforme des cellules isolées est également très bénéfique pour les expériences de fraisage par faisceau d’ions focalisés (cryo-FIB) afin de maximiser le nombre de cellules à partir desquelles la lamelle peut être coupée16.
L’ajout de micromotifs aux flux de travail cryo-EM entraînera des améliorations mesurables du débit de données et permettra potentiellement de nouvelles expériences. Au fur et à mesure que la technique sera adoptée et développée, des applications plus avancées du micromodèlement, y compris les gradients ECM, les dépôts ECM multiples et l’assemblage de microstructures, élargiront encore les capacités du cryo-ET pour étudier les cibles et les processus biologiques dans un contexte cellulaire complet.
The authors have nothing to disclose.
Nous remercions le Dr Jill Wildonger, le Dr Sihui Z. Yang et Mme Josephine W. Mitchell du Département de biochimie de l’Université du Wisconsin, Madison, d’avoir généreusement partagé la souche de mouche elav-Gal4, UAS-CD8::GFP (Bloomington stock center, #5146). Nous tenons également à remercier le Dr Aurélien Duboin, M. Laurent Siquier, Mme Marie-Charlotte Manus d’Alvéole et M. Serge Kaddoura de Nanoscale Labs pour leur généreux soutien au cours de ce projet. Ce travail a été soutenu en partie par l’Université du Wisconsin, Madison, le Département de biochimie de l’Université du Wisconsin, Madison, et les subventions des services de santé publique R01 GM114561, R01 GM104540, R01 GM104540-03W1 et U24 GM139168 à E.R.W. et R01 AI150475 à P.W.S. du NIH. Une partie de cette recherche a été soutenue par la subvention U24 GM129547 des NIH et réalisée au PNCC de l’OHSU et accessible via EMSL (grid.436923.9), une installation d’utilisateurs du DOE Office of Science parrainée par l’Office of Biological and Environmental Research. Nous sommes également reconnaissants de l’utilisation des installations et de l’instrumentation du Centre de recherche Cryo-EM du Département de biochimie de l’Université du Wisconsin, à Madison.
0.1% (w/v) Poly-L-Lysine | Sigma | P8920-100ML | |
0.22 µm syringe filters PVDF membrane | Genesee | 25-240 | |
22×60-1 Glass cover slip | Fisher | 12545F | |
5/15 Tweezers | EMS (Dumont) | 0203-5/15-PO | |
Antibiotic-Antimycotic (100X) | ThermoFisher (Gibco) | 15240096 | |
BEAS-2B cells | ATCC | CRL-9609 | |
Collagen I, bovine | ThermoFisher (Gibco) | A1064401 | |
Concanavalin A, Alexa Fluor 350 Conjugate | ThermoFisher (Invitrogen) | C11254 | |
DMEM | Fisher (Lonza) | BW12-604F | |
EtOH | Fisher (Decon Labs) | 22-032-600 | |
Fetal Bovine Serum | ATCC | 30-2020 | |
Fibrinogen From Human Plasma, Alexa Fluor 647 Conjugate | ThermoFisher (Invitrogen) | F35200 | |
Fibronectin Bovine Protein, Plasma | ThermoFisher (Gibco) | 33010018 | |
Glass bottom dish | MatTek | P35G-1.5-20-C | |
Glucose | VWR | 0643-1KG | |
Grid prep holder | EMS | 71175-01 | |
HeLa cells | ATCC | CCL-2 | |
Hemacytometer | Fisher (SKC, Inc.) | 22600100 | |
HEPES | Fisher (ACROS Organics) | AC172572500 | |
Hoechst 33342 | ThermoFisher (Invitrogen) | H3570 | |
Insulin | Fisher (Sigma Aldrich) | NC0520015 | |
KCl | MP Bio | 194844 | |
KH2PO4 | Fisher (ACROS Organics) | AC212595000 | |
Leica-DMi8 | Leica Microsystems | Can be customized with camera, stage, and objective attachments | |
Leonardo | Alvéole | https://www.alveolelab.com/our-products/leonardo-photopatterning-software/ | |
Liberase Research Grade | Fisher (Supply Solutions) | 50-100-3280 | |
LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit | ThermoFisher (Invitrogen) | L3224 | |
Microscope camera | Hammamatsu | C13440-20CU | |
Motorized stage | Märzhäuser Wetzlar | 00-24-599-0000 | |
NaCl | Fisher (Fisher BioReagents) | BP358-1 | |
NaH2PO4 | Fisher (ACROS Organics) | AC207802500 | |
NaOH | Fisher (Alfa Aesar) | AAA1603736 | |
PBS | Corning | 21-040-CV | |
PDMS stencils | nanoscaleLABS | PDMS_STENCILS_EM | https://www.alveolelab.com/our-products/pdms-stencil-multiwell-plate/ |
PEG-SVA | nanoscaleLABS | PEG-SVA-1GR | mPEG-Succinimidyl Valerate, MW 5,000 |
Penicillin | Fisher (Research Products International Corp) | 50-213-641 | |
pH strips | Fisher (Millipore Sigma) | M1095350001 | pH probe can also be used |
PLPP gel | nanoscaleLABS | PLPP-GEL-300UL | https://www.alveolelab.com/our-products/plpp-photoactivatable-reagent/ |
PRIMO | Alvéole | https://www.alveolelab.com/our-products/primo-micropatterning/ | |
pSynkRSV-I19F (BAC containing RSV A2-mK+ antigenomic cDNA ) | BEI Resources | NR-36460 | https://www.beiresources.org/Catalog/BEIPlasmidVectors/NR-36460.aspx |
Quantifoil grids | EMS (Quantifoil) | Q2100AR1 | 2 µm holes spaced 1 µm apart, other dimensions are available |
RPMI | Fisher (Lonza) | BW12-702F | |
RSV A2-mK+ | see entry for pSynkRSV-19F | – | Described in Hotard et al. [22]. Can be generated from pSynkRSV-ll9F |
Schneider's Media | ThermoFisher (Gibco) | 21720-024 | |
SerialEM | SerialEM (https://bio3d.colorado.edu/SerialEM/ ) | https://bio3d.colorado.edu/SerialEM/ | |
Straight tweezers | EMS (Dumont) | 72812-D | |
Streptomycin | Fisher (Fisher BioReagents) | BP910-50 | |
Sucrose | Avantor | 4097-04 | |
Tetracycline | Sigma | T8032-10MG | |
Titan Krios electron microscope | ThermoFisher | 300kV, with direct electron detector camera and energy filter | |
Trypsin | ThermoFisher (Gibco) | 15090046 | |
Tube Revolver/Rotator | Fisher (Thermo Scientific) | 11676341 | |
UAS:mcD8:GFP Drosophila fly strain | Bloomington Drosophila Stock Center | 5146 | http://flybase.org/reports/FBtp0002652.html |