微图案透射电子显微镜网格，用于在全细胞冷冻电子断层扫描工作流程中指导细胞定位

这里描述的方案是Wright实验室和威斯康星大学麦迪逊分校Cryo-EM研究中心使用的细胞培养，微图案和成像方法的汇编。工作流如图 1 所示。以下站点提供其他培训和教学材料：https://cryoem.wisc.edu 或 https://wrightlab.wisc.edu 1. 准备用于图案化的网格 将TEM网格转移到干净的载玻片上，碳面朝上（碳箔的标准厚度为12nm）。使用碳蒸发器 ACE600，将 5-8 nm 的额外碳蒸发到网格上，以提高整体碳膜的耐用性。注意：对于 SiO2 网格，此步骤不是必需的。此步骤也可以提前完成;将涂层网格存放在低湿度环境中，如真空干燥器。 将网格转移到网格准备支架上，并将网格碳面朝上释放辉光。使用辉光放电系统，在10 mA下辉光放电网格60秒，工作距离为80 mm，真空压力为1.0 x 10-3 mbar。在下一步后的15-30分钟内完成此操作。注意：网格准备支架可以商业购买或自制，并在小培养皿上使用一张滤纸自制。 2.防污层的应用 注意：处理网格时应使用适当的无菌技术，并且所有溶液都应无菌和/或过滤器灭菌。 将网格（碳面朝上）转移到干净的载玻片或盖玻片上，网格之间至少有1厘米的距离。将10μL0.05%聚-L-赖氨酸（PLL）移液到每个网格上。将网格在潮湿的室内孵育至少30分钟，例如带有湿纸巾的封闭塑料盒。注意：此步骤可以延长到一夜之间。确保腔室中的湿度水平足以防止网格变干。 用15μL 0.1 M HEPES pH 8.5洗涤每个网格三次。每次洗涤时，用移液器从网格中除去大部分液体，不要让网格干燥。加入15μL新鲜缓冲液，孵育至少30秒并重复。在最后一次洗涤后，将每个网格留在15μL0.1 M HEPES中。注意：在本步骤和后续步骤中，保持网格湿润并避免移液器与网格之间的接触非常重要。 为每个网格制备10μL100mg / mL聚乙二醇琥珀酰戊酸（PEG-SVA）在0.1 M HEPES pH 8.5中。PEG-SVA通过温和混合会迅速溶解，从而产生透明的溶液。注意：不要提前准备PEG-SVA溶液。PEG-SVA在pH 8.5下的半衰期为10分钟。避免将PEG-SVA储备物暴露在过多的水分中，将其储存在-20°C的干燥器或干燥环境中，并在开封前升温至室温。 制备PEG-SVA溶液后，立即从每个网格中取出15μLHEPES pH 8.5滴（注意不要干燥网格），并加入10μLPE-SVA溶液滴。将网格在潮湿的室内孵育至少1小时。注意：此步骤可以延长到一夜之间。确保腔室中的湿度足以防止网格变干。 用15μL无菌水洗涤每个网格三次。对于每次洗涤，用移液器从网格中除去大部分液体而不让网格干燥，加入15μL淡水，孵育至少30秒并重复。最后洗涤后，将每个网格留在15μL水中。 3. 涂抹PLPP凝胶 为每个网格准备一个干净的显微镜盖玻片。对每个网格完成以下步骤，一次一个网格，以最大程度地减少网格干涸的可能性。 在盖玻片的中心放置一滴1.0μL水，以帮助将网格放在盖玻片上并保持网格湿润。小心地将网格从15 μL水滴转移到盖玻片上的1.0 μL水滴。确保将网格碳侧朝上放置。 小心地将聚二甲基硅氧烷（PDMS）钢网放置在网格上，注意保持网格居中，并尽量减少钢网与网格碳箔的接触。 将1.0μL4-苯甲酰基苄基-三甲基氯化铵（PLPP）凝胶加入网格中。轻轻移液器混合（不要用移液器吸头触摸网格）。 将带有网格的盖玻片移动到黑暗位置以干燥。凝胶将在大约15-30分钟内干燥。 4. 微模式的校准和设计 用荧光笔为玻璃盖玻片的一面着色。从细尖永久标记中添加黑线，使对焦更容易。将盖玻片放在显微镜上，使彩色面朝向物镜。使用明场模式，将焦点放在荧光笔上。 确保显微镜和微图案系统已通电，并设置了正确的光路。在显微镜计算机上打开微观管理器和莱昂纳多软件（插件>莱昂纳多）。 选择校准，然后按照屏幕上的说明操作。调整显微镜焦点，使投影到载玻片上的图像对焦。暴露时间可能需要缩短。校准后，选择” 立即图案”。 记录程序左上角窗口中校准数据下报告的千分尺/像素（μm/px）比率（图2，区域1）。使用此比率可确定在设计图案时每微米要使用的像素数。 校准后，确保软件现在已打开，从显微镜获得实时明场视图。将盖玻片（第3部分）上准备好的网格加载到舞台上，网格朝向物镜。放置载物台并调整焦点，使网格在软件窗口中可见。 以微米为单位测量网格正方形和网格条的大小。该软件包括一个由左下角附近的按钮激活的标尺，用于测量网格（图2，区域2）。例如，此处用于 200 目网格的模式对应于 ~87 × 87 μm 网格正方形和 ~36 μm 网格条。注：该软件可以灵活地动态调整模式的大小，因此可以容忍测量中的轻微不准确。 根据上述测量和比率，使用任何图像创建软件创建图案。20×物镜的最小特征尺寸为1.2 μm。模式应另存为未压缩的 8 位.tiff文件。 确保软件在保存时不会将图像重新缩放到不同的像素大小。图案应适合 800 × 800 像素的框内，足以覆盖四个网格正方形。注意：值为 255（白色）的像素将以最高强度（激光的总剂量）进行图案化，值为零（黑色）的像素将不进行图案化。任何具有中间值的像素都将以大约（X/ 255）*总剂量的剂量进行图案化。在 图3A中，灰度图案使用像素值255和129。一旦设计了模式，就可以保存并重复使用，而无需修改。 5. 微图案化 校准后，确保软件现在已打开，从显微镜获得实时明场视图。将盖玻片（第3部分）上准备好的网格加载到舞台上，网格朝向物镜。定位舞台并调整焦点以查看软件中的网格。 对于初始运行，请设计一个新模板。在软件中，选择 “添加 ROI “（未显示，在 图 2 区域 3 的位置），然后选择一个 3，000 μm 的圆圈。使用屏幕上的明场图像作为指导，将圆圈ROI放置在网格上。按锁定以确保投资回报率。 将 ROI 锁定到位后，选择” 添加模式” （未显示，位于 图 2 区域 3 的位置）。选择第 4 节中设计的图案。将网格划分为六个区域，以允许在每个区域中独立聚焦和定位，以考虑不均匀的网格。一个 8 ×网格的每个角有 8 个网格正方形区域，中心每侧有一个 2 × 8 个网格方块区域，使中心四个网格正方形保持无图案（图 2，中心图）。 使用复制选项（图 2，区域 4）生成初始模式的副本，以达到所需的模式总副本数。如有必要，调整副本之间的间距以匹配网格正方形之间的间距。 设置 图案的总剂量 。30 mJ/mm2 是一个很好的起点。有关更多详细信息，请参阅讨论部分。 在 “专家选项” （图 2，区域 4）下，调整区域的角度以匹配网格正方形的角度。可以使用鼠标重新定位区域。图案的比例（大小）也可以调整。通过调整图案的角度、位置、间距和比例进行迭代，直到图案与网格正方形对齐。移动显微镜载物台以更改实时明场显示器中的网格区域。 按 “锁定” 保存对区域所做的更改。 要复制某个区域，请在左侧的”动作”面板中单击其名称旁边的”复制”按钮（图 2，区域 5，两张纸图标）。要重新定位、重命名或编辑副本，请在”动作”面板中单击其名称。 根据需要重复步骤 5.4-5.9 以填充所有所需区域。 设计和定位完整的模板后，将模板文件 保存 在软件中（图 2，区域 6，顶部工具栏中带有向上箭头图标的栏）。 加载以前保存的模板（带有向下箭头图标的条形）时，将 ROI 居中放在网格上，然后按 Lock。单击 “操作面板” 中的每个区域以更改角度、位置、剂量和/或图案文件。 定位模板和模式后，在软件的 “操作面板” 中取消选中除一个区域之外的所有区域。 使用显微镜载物台导航到该区域并聚焦在碳箔上。单击”动作”面板中的”眼球”图标（图 2，区域 5）将打开或关闭图案叠加的显示。 网格对焦后，关闭明场快门，然后按软件右下角的 “播放 “图标开始图案化过程，可以实时监控。 在操作面板中，选中下一个区域的框。打开明场快门，使网格可见，并使用显微镜载物台将该区域居中。对 操作面板中的每个区域重复步骤 5.13-5.14。 从显微镜中取出带有网格的盖玻片，并立即将10μL无菌磷酸盐缓冲盐水（PBS）移液到网格上。 10分钟后，用镊子取出模板，然后用15μLPBS洗涤网格3次。最终洗涤后，将每个网格置于15μLPBS中，并将网格移动到黑暗位置。 6. ECM蛋白的沉积 对于培养的细胞，请遵循步骤6.2-6.5;对于原发 性果蝇 神经元，请遵循步骤 6.6-6.10。 为每个网格准备至少15μL的ECM。对于BEAS-2B细胞，在无菌PBS中制备终浓度为0.01mg / mL牛纤连蛋白和0.01mg / mL荧光团偶联纤维蛋白原。对于HeLa细胞，在无菌PBS中制备0.01mg / mL牛胶原I和0.1mg / mL荧光团结合纤维蛋白原。 从每个网格中取出大部分PBS，并应用15μL的ECM。将电网在室温下的潮湿室中孵育至少1小时。注意：该步骤可以在4°C下延长至过夜。 在 ECM 中孵育后，用无菌 PBS 洗涤每个网格 5 次。每次洗涤时，用移液器除去大部分液体，不要让网格干燥，加入15μL新鲜PBS，孵育至少30秒，然后重复。在最终洗涤后，将每个网格留在PBS中。注意：网格可以在4°C的PBS中储存长达一周，而不会观察到质量下降。 使用荧光显微镜检测ECM中的荧光团，以确认图案化以及碳箔保持完整。一些破碎的方块通常是可以容忍的。 对于原发 性果蝇 神经元，将图案网格移动到含有无菌PBS的30毫米玻璃底皿中。 从培养皿中吸出PBS，并施用2mL 0.5mg / mL荧光团偶联的康那瓦林A.在无菌环境中在25°C孵育过夜。 从培养皿中取出康那瓦林A溶液（不干燥网格），并用PBS洗涤网格3次。每次洗涤时，从培养皿中加入并取出 2 mL PBS。 使用荧光显微镜检测ECM中的荧光团，以确认图案化以及碳箔保持完整。一些破碎的方块通常是可以容忍的。 最后洗涤后，从玻璃底培养皿中取出PBS，加入2mL新鲜制备的，无菌过滤的补充施耐德果蝇培养基21，含有20%热灭活胎儿牛血清（FBS），5μg/ mL胰岛素，100μg/ mL青霉素，100μg/ mL链霉素和10μg/ mL四环素。在无菌环境中孵育25°C，直到神经元准备好接种。 7. 接种前原代 果蝇 细胞的制备 用70%EtOH对55mm解剖皿进行灭菌，然后将2-3mL无菌过滤的1×解剖盐水（9.9mM HEPES pH 7.5，137mM NaCl，5.4mM KCl，0.17mM NaH2PO4，0.22mM KH2PO4，3.3mM葡萄糖，43.8mM蔗糖）21。 使用一对镊子从食物中轻 轻挑选30-40个3龄幼虫。 将幼虫放入具有1×PBS的管中，然后将它们转移到具有1×PBS的第二管中以洗涤幼虫。 将幼虫转移到具有70%EtOH的管中以洗掉PBS，然后将它们转移到具有70%EtOH的第二管中。将幼虫留在第二管中2-3分钟以对幼虫进行灭菌。 将幼虫转移到具有1×解剖盐水的管中，然后立即将它们转移到具有1×解剖盐水的第二管中。 将单个幼虫转移到含有1×解剖盐水的解剖皿中。用一对镊子和一台解剖显微镜，快速撕裂每个幼虫以提取大脑，并用1×解剖盐水将其转移到第三管。重复此步骤，直到提取所有大脑。 将含有大脑的管子以300× g 离心1分钟。 弃去上清液，用1mL的1×解剖盐水洗涤，并以300×g离心管1分钟。再次重复此步骤。 弃去上清液，直到200-250μL留在管中，并在1x解剖盐水中加入20μL2.5mg / mL Liberase。 在室温下旋转管子在旋转器上旋转1小时;在此期间，每10分钟移取溶液25-30次。到最后，溶液应该稍微不透明。 将细胞以300× g 离心5分钟。 弃去上清液，然后加入1 mL补充的施耐德培养基。将溶液移取30次以混合。 将细胞以300× g 离心5分钟。 弃去上清液，并通过加入1mL补充的施耐德培养基洗涤细胞沉淀。将溶液移取30次以混合。 将细胞以300× g 离心5分钟。 弃去上清液，然后用300μL补充的施耐德培养基重悬细胞沉淀。将溶液移取30-40次以混合。 8. BEAS-2B和HeLa细胞的培养和RSV感染 将HeLa细胞和BEAS-2B细胞维持在37°C和5%CO 2的T75烧瓶中。每3-4天传代细胞一次达到约80%的汇合度。维持HeLa细胞在DMEM + 10S + 1×抗生素 – 抗真菌剂。维持BEAS-2B在RPMI + 10S + 1×抗生素 – 抗真菌药6，22，23。 对于未感染细胞的接种，请跳到第9部分。BEAS-2B和HeLa细胞容易受到RSV感染;BEAS-2B细胞用于此处显示的涉及RSV的所有实验。注意：使用适当的生物安全柜（BSC）和个人防护装备（PPE），按照机构规程执行所有BSL-2步骤。 在细胞RSV感染之前，将5×104 个细胞每孔传代到具有2mL生长培养基的6孔板（表面积〜9.6 cm 2）中并孵育过夜。 胰蛋白酶消化并计数一个细胞孔。要进行胰蛋白酶消化，从一个孔中吸出培养基，并用2 mL不含Mg2 +和Ca2 +的无菌PBS洗涤以除去残留的培养基。加入500μL0.25%胰蛋白酶溶液。在37°C孵育5-10分钟。定期检查细胞，看看它们是否从表面释放出来。一旦细胞被释放，加入1.5mL培养基。 将100μL胰蛋白酶消化细胞与100μL台盼蓝混合。将10μL稀释的细胞混合物移液到血细胞计数器中。计算细胞数并计算每个孔的细胞数。使用此数字在下面计算 MOI。 在生长培养基中制备RSV-A2mK + 24 的稀释液，以在750μL培养基中达到每孔10的MOI。RSV-A2mK+的MOI可以通过储备的荧光聚焦单位（FFU）滴度计算（例如：对于1.0×每孔105 个细胞和1.0×108 FFU / mL的RSV储备，将病毒储液稀释1：75至1×106 FFU / 750μL或1.33×106 FFU / mL）。 从6孔培养皿中的细胞中吸出培养基，并从上方向每个孔中加入750μL病毒溶液。 在室温下摇动板1小时。 1小时后，将每孔的总体积提高到2mL，将生长培养基预热至37°C，并将板置于设置为37°C的培养箱中，其中5%CO 26 小时。 胰蛋白酶消化细胞以释放它们并继续接种，如下所述。播种后，在冷冻前将网格再孵育18小时（感染后总共24小时）。 9. 细胞接种到微图案网格上 对于培养的细胞，请遵循步骤9.2-9.8;对于原发 性果蝇 神经元，请遵循9.9-9.11。 胰蛋白酶消化细胞以释放它们（参见上面第8节中的步骤4）。为了减少细胞聚集，胰蛋白酶消化细胞以60%或更低的汇合度。 将100μL胰蛋白酶消化细胞与100μL台盼蓝混合。将10μL稀释的细胞混合物移液到血细胞计数器中并计数细胞。 将培养基中的细胞稀释至2×104 个细胞/ mL。 将1μL培养基加入30 mm玻璃底皿的中心，以帮助放置网格并防止其干燥。将网格从盖玻片上的PBS转移到玻璃底盘的中心。将10μL细胞溶液加入网格中。 使用明场显微镜，观察5分钟后细胞粘附到网格上。如果大多数图案仍然未被占用，则再加入10μL细胞溶液滴。在孵育期间将网格和细胞溶液保持在37°C。 重复步骤 9.6，直到大多数模式被占用或许多已占用的模式开始具有多个单元格。在培养箱（37°C，5%CO 2）中孵育网格2小时。 用2 mL预热的培养基淹没培养皿并孵育过夜（37°C，5%CO 2）。 对于原发 性果蝇 神经元，从含有网格的培养皿中取出培养基并将细胞平板到培养皿上。 等待30-60分钟，让细胞附着，然后加入2毫升补充的施耐德培养基。 在25°C培养箱中培养神经元至少2-3天，然后沉入冷冻。 10. 图案网格的成像和玻璃化 将含有图案网格和培养细胞的玻璃底培养皿放在荧光显微镜上。 使用明场和适当的荧光通道获取网格图像，以检测细胞中的图案和任何其他标记。确保细胞密度和定位适合下游成像和分析。注：明场和荧光图像在斐济软件包中处理25。 准备一个低温冰箱;冷冻设备的类型将取决于最适合样品的可用性，成本和功能。注意：原发 果蝇 神经元在自动沉降冷冻机上制备，BEAS-2B细胞使用半自动沉降冷冻机制备。 将金基准应用于样品，以使倾斜系列正确对齐。将样品吸走以除去多余的介质，然后将样品放入冷冻剂中，例如由液氮冷却的液体乙烷。对于原发 性果蝇 神经元，从背面印迹4秒。对于HeLa和BEAS-2B细胞，从两侧印变4-6秒。然后，冷冻的网格可以储存在液氮中，直到进一步使用。 在冷冻电子显微镜中对玻化细胞进行成像，使用直接电子探测器相机在300 kV下操作。使用SerialEM26等软件为每个感兴趣的区域设置倾斜系列收集，用于冷冻电镜/冷冻ET数据收集。注意：在-60°至60°的直接电子探测器上以2°的增量以-8μm散焦的增量在-8μm散焦下从-60°双向收集原始 果蝇 神经元的倾斜系列，总剂量为70-75 e-/ Å2。在带有能量滤波器（20 eV狭缝）的直接电子探测器上收集RSV感染的BEAS-2B的倾斜系列，散焦为-5μm，像素尺寸为4.603 Å，总剂量约为80 e-/Å2。 处理倾斜系列以重建断层扫描图。注：此处介绍的断层扫描是使用IMOD软件包27重建的;低通滤波是使用EMAN2软件包28完成的。