全細胞クライオ電子断層撮影ワークフロー内での細胞位置のダイレクト位置を測定するマイクロパターン化透過電子顕微鏡グリッド

ここで説明するプロトコルは、ウィスコンシン大学マディソン校のライトラボとクライオEM研究センターで使用される細胞培養、マイクロパターニング、イメージング方法のコンパイルです。ワークフローは図 1 に示されています。その他のトレーニングおよび指導教材は、https://wrightlab.wisc.edu https://cryoem.wisc.edu 次のサイトで入手できます。 1. パターニング用グリッドの作成 TEMグリッドをクリーンなガラススライドに移し、カーボンサイドアップ(カーボン箔の標準厚さは12nm)します。炭素蒸発器ACE600を使用して、5~8nmの追加炭素をグリッド上に蒸発させ、カーボンフィルムの耐久性を全体的に向上させます。注: このステップは SiO2 グリッドには必要ありません。この手順は、事前に行うこともできます。真空デシケータなどの低湿度環境でコーティングされたグリッドを保管してください。 グリッドをグリッド準備ホルダーに移し、グリッドのカーボンサイドをグロー放電します。グロー放電システムを使用して、グロー放電は、80 mmの作動距離と1.0 x 10-3 mbarの真空圧で10 mAで60 sのグリッドを排出します。次のステップから15~30分以内に行います。注:グリッドの準備ホルダーは、商業的に購入したり、小さなペトリ皿にフィルターペーパーの一部で自家製することができます。 2. 反汚れ層の適用 注:適切な滅菌技術は、グリッドを扱うときに使用する必要があり、すべてのソリューションは滅菌および/またはフィルタ滅菌する必要があります。 グリッド(カーボンサイドアップ)を、グリッド間の分離を少なくとも1cmで、きれいなガラススライドまたはカバースリップに移します。ピペット10 μLの0.05%ポリL-リジン(PLL)を各グリッドに取り付けます。湿ったペーパータオルで囲まれたプラスチック製の箱など、湿った部屋にグリッドを少なくとも30分間インキュベートします。注: この手順は夜間に拡張できます。チャンバーの湿度レベルは、グリッドが乾燥するのを防ぐために十分であることを確認してください。 0.1 M HEPES pH 8.5の15 μLで各グリッドを3回洗浄します。洗浄ごとに、グリッドを乾燥させることなく、ピペットでグリッドから液体のほとんどを取り除きます。15 μLの新鮮なバッファーを加え、少なくとも 30 秒分インキュベートして繰り返します。最終洗浄後、各グリッドを0.1 M HEPESの15 μLに残します。注: この手順と今後の手順では、グリッドを濡に保ち、ピペットとグリッドの間の接触を避けることが重要です。 100 mg/mL ポリエチレングリコール-コシニミジル(PEG-SVA)を0.1 M HEPES pH 8.5で各グリッドに10μL調製します。PEG-SVAは、穏やかな混合ですぐに溶解し、明確な溶液をもたらします。注: PEG-SVA ソリューションを事前に準備しないでください。PEG-SVAは、pH 8.5で10分の半減期を有する。ペグ-SVAストックを-20°Cの乾燥環境に保管し、開封前に室温に温めることで、過度の水分にさらすことを避けてください。 PEG-SVA溶液を準備した直後に、各グリッドからHEPES pH 8.5の15μLドロップを取り除き(グリッドを乾燥させないように注意して)、PEG-SVA溶液の10 μLドロップを追加します。少なくとも1時間湿度の高いチャンバーにグリッドをインキュベートします。注: この手順は夜間に拡張できます。チャンバーの湿度が十分であり、グリッドが乾燥するのを防ぎます。 各グリッドを15μLの無菌水で3回洗います。洗浄ごとに、グリッドを乾燥させることなく、ピペットでグリッドから液体の大部分を取り出し、15 μLの淡水を加え、少なくとも30秒インキュベートして繰り返します。最終洗浄後、各グリッドを15μLの水に入れておきます。 3. PLPPゲルの塗布 各グリッドにクリーンな顕微鏡カバースリップを用意します。グリッドが乾燥する可能性を最小限に抑えるために、グリッドごとに一度に 1 つのグリッドに対して次の手順を実行します。 カバースリップの中央に1.0 μLの水滴を置くと、カバースリップの上にグリッドを配置し、グリッドを濡らします。15 μLの水滴からカバースリップの1.0 μLの水滴に慎重にグリッドを移します。グリッドカーボン側を上に置くようにしてください。 グリッドの中央に保ち、グリッドのカーボンフォイルとのステンシル接触を最小限に抑えるように注意して、グリッドの上にポリジメチルシロキサン(PDMS)ステンシルを慎重に配置します。 4-ベンゾイルベンジルトリメチルアンモニウムクロリド(PLPP)ゲルの1.0 μLをグリッドに加えます。ピペットを軽く混ぜ合わせます(ピペットチップでグリッドに触れないでください)。 グリッド付きのカバースリップを暗い場所に移動して乾燥させます。ゲルは約15〜30分で乾燥します。 4. マイクロパターンの較正と設計 ガラスカバースリップの片側に蛍光ペンを塗ります。細かい先端のパーマネントマーカーから黒い線を追加して、焦点を合わせやすくします。色付きの側が対物レンズに面するような顕微鏡の上にカバースリップを置きます。明視野モードを使用して、蛍光ペンに焦点を当てます。 顕微鏡とマイクロパターニングシステムの電源が入っており、正しい光路が設定されていることを確認します。マイクロマネージャーとレオナルドソフトウェア(レオナルド>プラグイン)を顕微鏡コンピュータで開きます。 [調整]を選択し、画面の指示に従います。スライドに投影された画像が焦点になるように、顕微鏡の焦点を調整します。露光時間を短縮する必要があります。キャリブレーション後、[ 今すぐパターン]を選択します。 プログラムの左上のウィンドウで、キャリブレーションデータで報告されたマイクロメートル/ピクセル(μm/px)比を記録します(図2、エリア1)。この比率を使用して、パターンを設計する際に 1 マイクロメートル当たりのピクセル数を決定します。 キャリブレーション後、ソフトウェアがマイクロスコープからのライブ明視野で開かれていることを確認します。準備したグリッドをカバースリップ(セクション3)にロードし、グリッドを対物レンズに向けてステージに置きます。ステージを配置し、ソフトウェア ウィンドウにグリッドが表示されるようにフォーカスを調整します。 グリッドの正方形とグリッド バーのサイズをマイクロメートル単位で測定します。ソフトウェアには、グリッドを測定するために左下隅付近のボタンでアクティブにされた定規が含まれています(図2、領域2)。たとえば、200 メッシュグリッドに使用されるパターンは、87 μm のグリッド正方形と約 36 μm のグリッドバー× 87 に対応します。注:ソフトウェアは、その場でパターンのサイズを変更する柔軟性を提供するので、測定のわずかな不正確さを許容することができます。 上記の測定と比率に基づいて、任意のイメージ作成ソフトウェアでパターンを作成します。20×の目標を持つ最小特徴サイズは1.2 μmです。パターンは、非圧縮の8ビット.tiffファイルとして保存する必要があります。 保存時に、イメージが別のピクセルサイズに再スケールされないようにします。パターンは、4 つのグリッド正方形をカバーするのに十分な 800 × 800 ピクセルのボックス内に収まる必要があります。注: 値が 255 (白) のピクセルは、最大強度 (レーザーの総線量) でパターン化され、ゼロ (黒) の値を持つピクセルはパターン化されません。中間値を持つピクセルは、およそ(X/255)*合計線量の線量でパターン化されます。 図3Aでは、グレースケールパターンに255と129のピクセル値が使用されました。パターンが設計されると、変更せずに保存して再利用することができます。 5. マイクロパターン キャリブレーション後、ソフトウェアがマイクロスコープからのライブ明視野で開かれていることを確認します。準備したグリッドをカバースリップ(セクション3)にロードし、グリッドを対物レンズに向けてステージに置きます。ステージを配置し、ソフトウェアのグリッドを表示するようにフォーカスを調整します。 最初の実行では、新しいテンプレートをデザインします。ソフトウェアで、[ ROI の追加 ]( 図 2 領域 3 の場所に示されていない)を選択し、3,000 μm の円を選択します。画面の明視野画像をガイドとして使用して、グリッド上に円 ROI を配置します。ロックを押して ROI を固定します。 ROI を所定の位置にロックしたら、[ パターンの追加 ] を選択 します (図 2 の領域 3 の位置には表示されません)。セクション 4 でデザインしたパターンを選択します。グリッドを 6 つの領域に分割して、各領域での独立した焦点と位置決めを行い、不均一なグリッドを考慮します。グリッドの各コーナーに 8 グリッド正方形の領域を×し、中心の両側に 2 × 8 グリッド正方形の領域を設定し、中央の 4 つのグリッド四角形をパターン化しません (図 2、中央の画像)。 レプリケーション・オプション (図 2、エリア 4) を使用して、初期パターンのコピーを生成して、パターンの合計コピーの所望の数に達します。必要に応じて、コピーの間隔をグリッドの正方形の間隔に合わせて調整します。 パターンの 総線量 を設定します。30 mJ/mm2 は良い出発点です。詳細については、ディスカッションのセクションを参照してください。 [ エキスパート オプション] (図 2、エリア 4)で、グリッドの正方形に合わせて領域の角度を調整します。領域はマウスを使用して再配置できます。パターンの比率(サイズ)も調整できます。パターンがグリッドの正方形に合わせるまで、パターンの角度、位置、間隔、および比率を調整します。ライブ明視野ディスプレイでグリッドの領域を変更するために顕微鏡のステージを移動します。 [ロック]を押して、領域に加えた変更を保存します。 リージョンをコピーするには、左側のアクションパネルで、名前の横にある「複製」ボタン(図2、領域5、用紙2枚のアイコン)をクリックします。コピーの位置を変更、名前変更、編集するには、[アクション]パネルでコピーの名前をクリックします。 必要な領域をすべて埋めるために、必要に応じて手順 5.4 ~ 5.9 を繰り返します。 テンプレート全体をデザインして配置したら、ソフトウェア内にテンプレート ファイルを 保存 します (図 2、領域 6、上のツールバーの上矢印アイコンを付けて横棒)。 以前に保存したテンプレート(下矢印アイコンのバー)をロードすると、ROIがグリッドの中央に配置され、[ ロック]を押します。 アクションパネル の各領域をクリックして、角度、位置、線量、パターンファイルを変更します。 テンプレートとパターンを配置したら、ソフトウェアの アクションパネル でリージョンの1つを除くすべてのチェックボックスをオフにします。 顕微鏡ステージを使用して、その領域に移動し、炭素箔に焦点を当てます。アクションパネル(図2、エリア5)で眼球アイコンをクリックすると、パターンオーバーレイの表示/非表示が切り替わります。 グリッドにフォーカスが合ったら、明視野シャッターを閉じてソフトウェアの右下隅にある 再生 アイコンを押して、ライブで監視できるパターニングプロセスを開始します。 アクションパネルで、次のリージョンのボックスを選択します。明視野シャッターを開けてグリッドが見えるようにし、顕微鏡ステージを使用してその領域を中央に配置します。 アクションパネルの各領域について、手順 5.13 ~ 5.14 を繰り返します。 顕微鏡からグリッド付きのカバースリップを取り外し、すぐに10μLの無菌リン酸緩衝生理食塩分(PBS)をグリッドにピペットします。 10分後、ピンセットでステンシルを取り外し、15 μLのPBSでグリッド3xを洗います。最後の洗浄の後、各グリッドをPBSの15 μLに入れ、グリッドを暗い場所に移動します。 6. ECMタンパク質のデポジション 培養細胞の場合は、手順 6.2 ~ 6.5 に従います。第一次 ショウジョウバエ ニューロンの場合、ステップ6.6-6.10に従ってください。 各グリッドに対して、少なくとも15 μLのECMを用意します。BEAS-2B細胞の場合、滅菌PBSで0.01mg/mLウシフィブロネクチンおよび0.01mg/mLフルオロフォア共役フィブリノーゲンの最終濃度を調製します。HeLa細胞の場合、0.01 mg/mLウシコラーゲンIと0.1mg/mLフルオロフォア共役フィブリノーゲンを滅菌PBSで調製します。 各グリッドからPBSの大部分を取り出し、15 μLのECMを適用します。少なくとも1時間室温で湿気の多いチャンバーにグリッドをインキュベートします。注:このステップは、4°Cで一晩まで延長することができます。 ECMでインキュベーションした後、各グリッド5xを滅菌PBSで洗浄します。洗浄ごとに、グリッドを乾燥させることなくピペットで液体の大部分を取り出し、新鮮なPBSを15 μL加え、少なくとも30秒インキュベートし、繰り返します。最終洗浄後、各グリッドをPBSに残します。注:グリッドは、PBSで4°Cで最大1週間保存することができ、品質の劣化は観察されません。 蛍光顕微鏡を使用してECMの蛍光素を検出し、パターニングを確認し、カーボン箔がそのまま残っていることを確認します。いくつかの壊れた正方形は、一般的に許容可能です。 第一次 ショウジョウバエ ニューロンの場合は、パターン化されたグリッドを滅菌PBSを含む30mmガラス底皿に移動します。 皿からPBSを吸引し、無菌環境で25°Cで一晩インキュベート0.5mg/mLフルオロフォアコンジュゲートコンジュゲートコンジュ化コンカナバリンA.インキュベートの2 mLを適用します。 コンカナリンA溶液を皿から取り出し(グリッドを乾燥させることなく)、グリッド3xをPBSで洗います。洗うごとに、皿から2mL PBSを加えて取り出します。 蛍光顕微鏡を使用してECMの蛍光素を検出し、パターニングを確認し、カーボン箔がそのまま残っていることを確認します。いくつかの壊れた正方形は、一般的に許容可能です。 最後の洗浄後、 ガラス底皿からPBSを取り出し、20%の加熱不活性化胎児ウシ血清(FBS)、5 μg/mLインスリン、100 μg/mLストレプトマイシン、100 μg/mLストレプマイシン、100 μg/mLストレプマイシン、100 μg/mLストレプマイシン、100 mL/μgを含む、新たに調製した無菌濾過されたシュナイダーの ショウジョウバエ 培地21を加えます。ニューロンがメッキされる準備ができるまで、滅菌環境で25°Cでインキュベートします。 7. 播種前の第 一次ショウジョウバエ 細胞の調製 70%のEtOHで55mm解剖皿を殺菌し、 そして、滅菌濾過1×解剖生理食動の皿に追加します(9.9 mM HEPES pH 7.5、137 mM NaCl、5.4 mM KCl、0.17 mM NaH2PO4、0.22 mM KH2PO4、3.3 mMグルコース、43.8mucm sucs)21)。 ピンセットを使用して食品から優しく30-40第3イン スター幼虫を選びます。 1×PBSで幼虫をチューブに入れ、1×PBSで2番目のチューブに移して幼虫を洗います。 70%のEtOHで幼虫をチューブに移してPBSを洗い流し、70%のEtOHで2番目のチューブに移します。幼虫を殺菌するために2-3分間2番目のチューブに幼虫を残します。 幼虫を1×解剖生理食音でチューブに移し、すぐに1×解剖生理食音で2番目のチューブに移します。 1×解剖生理食糸を含む解剖皿に個々の幼虫を移す。鉗子と解剖顕微鏡を使用して、各幼虫を素早く引き裂いて脳を抽出し、1×解剖生理で3番目の管に移します。すべての脳が抽出されるまで繰り返します。 脳を含むチューブを1分間300xgで遠心分離する。 上清を捨て、1mLの1×解剖生理食置で洗浄し、チューブを300xgで1分間遠心分離します。この手順をもう一度繰り返します。 上清を200~250μLまでチューブに残し、2.5mg/mLリベラーゼを20μL1x解剖サリンに加えます。 室温で1時間回転する回転器のチューブを回します。この時間の間に、10分ごとに溶液を25〜30回ピペットします。最終的には、ソリューションは少し不透明になります。 300× g で細胞を遠心分離して5分間行います。 上清を捨て、シュナイダーのメディアを1mL追加します。溶液を30回混合するピペット。 300× g で5分間遠心分離する。 上清を捨て、補助シュナイダーの培地を1mL加えて細胞ペレットを洗います。溶液を30回混合するピペット。 300× g で細胞を5分間遠心分離する。 上清を捨て、次に、300 μLのシュナイダーの培地で細胞ペレットを再懸濁します。溶液を30〜40回混合するピペット。 8. BEAS-2BおよびHeLa細胞の培養およびRSV感染 37°Cおよび5%CO2でT75フラスコのHeLa細胞およびBEAS-2B細胞を維持する。3~4日毎に細胞が約80%の合流度に達する。DMEM + 10% FBS + 1×抗生物質抗ミコティックでHeLa細胞を維持します。BEAS-2B を RPMI + 10% FBS + 1×抗生物質抗菌薬 6,22,23 で維持します。 感染していない細胞のシード処理については、セクション 9 に進みます。BEAS-2B および HeLa 細胞は RSV 感染の影響を受けやすい;BEAS-2B細胞は、ここに示すRSVを含むすべての実験に使用した。注:適切なバイオセーフティキャビネット(BSC)と個人用保護具(PPE)を使用して、機関プロトコルに準拠してBSL-2手順をすべて実行します。 細胞のRSV感染前に、2mLの増殖培地を用いて6ウェルプレート(表面積〜9.6cm2)に1ウェルあたり5×104個の細胞を通し、一晩インキュベートする。 トリプシン化し、細胞の1つの井戸を数えます。トリプシン化するには、1つのウェルから培地を吸引し、Mg2+ およびCa2+ なしで2mLの無菌PBSで洗浄し、残留培地を除去する。0.25%のトリプシン溶液を500μL加えます。37°Cで5~10分間インキュベートします。セルがサーフェスから放出されているかどうかを定期的にチェックします。細胞が放出されたら、1.5mLの培養培地を加える。 トリパンブルーの100 μLとトリプシン化細胞の100 μLを混合します。ピペット10μLの希釈細胞をヘモサイトメーターに混合する。セルをカウントし、ウェルあたりのセル数を計算します。この数値を使用して、以下の MOI を計算します。 750 μL のメディアで 1 ウェルあたり 10 の MOI を達成するために、成長メディアで RSV-A2mK+24 の希釈を準備します。RSV-A2mK+のMOIは、ストックの蛍光焦点単位(FFU)力素(例えば、1.0×105細胞のウェルと1.0×108 FFU/mLのRSVストック)から計算することができ、ウイルスストック1:75~1×106 FFU/750 μLまたは1.33×106FFUL/ 6ウェル皿の細胞から培地を吸引し、上から各ウェルに750 μLのウイルス溶液を加えます。 室温でプレートを1時間揺らす。 1時間後、成長培地を37°Cに予め温めて2mLまでのウェルあたりの総体積を持ち込み、プレートを37°Cに設定し、5%CO2 を6時間調整してインキュベーターに入れる。 細胞をトリプシン化してそれらを放出し、以下に説明するように播種に進む。播種後、凍結する前に、さらに18時間グリッドをインキュベートします(感染後の合計24時間)。 9. マイクロパターン化されたグリッドにセルをシード 培養細胞の場合は、手順 9.2 ~ 9.8 に従います。第一次 ショウジョウバエ ニューロンの場合は、9.9-9.11に従ってください。 細胞をトリプシン化して放出する(上記のセクション8のステップ4を参照)。細胞凝集を減らすには、細胞を60%以下の合流度でトリプシン化する。 トリパンブルーの100 μLとトリプシン化細胞の100 μLを混合します。希釈した細胞のピペット10μLは、ヘモサイトメーターに混合し、細胞を数えます。 培地中の細胞を2×104 細胞/mLに希釈します。 30 mm ガラス底皿の中央に 1 μL のメディアを加え、グリッドの配置を支援し、乾燥を防ぎます。カバースリップのPBSからガラス底皿の中央にグリッドを移します。10 μLのセル溶液をグリッドに追加します。 明視野顕微鏡を使用して、5分後にグリッドへの細胞接着を観察します。パターンの大部分が占有されていない場合は、セル溶液の10 μLドロップを追加します。インキュベーション中は、グリッドとセル溶液を37°Cに保ちます。 ほとんどのパターンが占有されるか、または多数のパターンが複数のセルを持ち始めるまで、ステップ 9.6 を繰り返します。インキュベーター(37°C、5%CO2)で2時間グリッドをインキュベートします。 2 mLの事前温めた培地で皿をあふれさせ、一晩(37°C、5%CO2)インキュベートします。 第一次 ショウジョウバエ ニューロンの場合は、グリッド含有皿から培地を取り出し、細胞を皿に盛り付けます。 細胞が取り付けるまで30〜60分待ってから、2mLの補足シュナイダーの培地を加えます。 25°Cインキュベーターで、2~3日間、プランジ凍結前にニューロンを培養する。 10. パターン化されたグリッドのイメージングとガラス化 パターングリッドと培養細胞を含むガラス底皿を蛍光顕微鏡に置きます。 明視野と適切な蛍光チャネルを使用してグリッドの画像を取得し、細胞内のパターンおよびその他の標識を検出します。細胞密度と位置決めが下流のイメージングと解析に適していることを確認します。注意:ブライトフィールドと蛍光画像は、フィジーソフトウェアパッケージ25で処理されました。 クライオプランジ冷凍庫を準備します。凍結デバイスの種類は、サンプルに最適な可用性、コスト、および機能によって異なります。注:一次 ショウジョウバエ ニューロンは自動プランジフリーザーで調製され、BEAS-2B細胞は半自動プランジ冷凍庫を使用して調製されました。 チルトシリーズの適切な位置合わせのために、サンプルに金の受託者を適用します。余分な培地を除去するためにサンプルをブロットし、液体窒素で冷却した液体エタンなどの凍結物質にサンプルを突っ込んで凍結する。第一次 ショウジョウバエ ニューロンの場合、裏側から4 sのブロット。HeLaおよびBEAS-2B細胞の場合、4-6sの両側からブロットする。凍結されたグリッドは、さらに使用されるまで液体窒素に保存することができます。 クリオ電子顕微鏡でガラス化細胞を画像化し、直接電子検出器カメラで300kVで操作した。クライオEM/cryo-ETデータ収集用のシリアルEM26 などのソフトウェアで、対象地域ごとにチルトシリーズコレクションを設定します。注:一次ショウジョウバエニューロンの傾きシリーズは、70-75 e/Å2の総用量で4.628 Åのピクセルサイズで-8 μmの焦点を離して2°増分で-60°から60°の双方向に直接電子検出器上で収集しました。RSV感染BEAS-2Bのチルトシリーズは、4.603 Åのピクセルサイズと〜80 e/Å2の合計用量で-5 μmの焦点が焦点を当てたエネルギーフィルター(20 eVスリット)を備えた直接電子検出器上で収集した。 傾斜系列を処理して、トモグラムを再構築します。注: ここで紹介したトモグラムは IMOD パッケージ27を使用して再構築されました。ローパスフィルタリングは、EMAN2ソフトウェアパッケージ28を使用して行われました。