Proporcionamos un protocolo para generar un modelo farmacológico de ratón de distonía DYT/PARK-ATP1A3 mediante la implantación de cánulas en ganglios basales y cerebelo conectados a bombas osmóticas. Describimos la inducción de movimientos similares a la distonía a través de la aplicación de un desafío motor y la caracterización del fenotipo a través de sistemas de puntuación conductual.
Los modelos de ratón modificados genéticamente se enfrentan a limitaciones, especialmente cuando se estudian trastornos del movimiento, donde la mayoría de los modelos de roedores transgénicos disponibles no presentan un fenotipo motor que se asemeje a los aspectos clínicos de la enfermedad humana. Los modelos farmacológicos de ratón permiten un estudio más directo de los pathomecanismos y su efecto en el fenotipo conductual. Las bombas osmóticas conectadas a las cánulas cerebrales abren la posibilidad de crear modelos farmacológicos de ratón a través de la administración de fármacos locales y crónicos. Para el trastorno del movimiento hereditario del disctonismo-parkinsonismo de inicio rápido, la mutación de pérdida de función en la subunidad de 3 de la Na+/K+-ATPase puede ser simulada por un bloqueo altamente específico a través de la ouabaína de glucósido. Con el fin de bloquear localmente la subunidad de 3o en los ganglios basales y el cerebelo, que son las dos estructuras cerebrales que se cree que están muy involucradas en la patogénesis del distonismo-parkinsonismo de inicio rápido, una cánula bilateral se implanta estereotizaxóxamente en el estriado y se introduce una canula única adicional en el cerebelo. Las cánulas están conectadas a través de tubos de vinilo a dos bombas osmóticas, que se implantan por vía subcutánea en la parte posterior de los animales y permiten la entrega crónica y precisa de ouabain. El modelo farmacológico del ratón para el distonismo-parkinsonismo de inicio rápido tiene la ventaja adicional de recapitular las características clínicas y patológicas de los portadores de mutaciones asintomáticas y sintomáticas. Al igual que los portadores de mutaciones del parkinsonismo de distonía de inicio rápido, los ratones perfundidos con ouabaína desarrollan movimientos similares a la distonía sólo después de una exposición adicional al estrés. Demostramos un paradigma de estrés suave e introducimos dos sistemas de puntuación modificados para la evaluación de un fenotipo motor.
Las ventajas de una entrega continua de medicamentos directamente en el cerebro son numerosas. Inyecciones repetitivas y frecuentes, que representan un factor de estrés innecesario para los animales, se puede evitar y se puede lograr una concentración intracerebral más constante de la droga. Esto es especialmente válido cuando los medicamentos administrados sistémicamente no logran penetrar fácilmente la barrera hematoencefálica. Por otra parte, la administración de fármacos crónicos a través de bombas osmóticas permite la entrega localizada de sustratos que de otro modo tendrían efectos secundarios en todo el sistema. Los fármacos pueden ser entregados de una manera dirigida a las estructuras cerebrales deseadas, el efecto resultante puede ser rastreado directamente. Esto se puede utilizar para una serie de aplicaciones, tales como el estudio de efectos terapéuticos, así como el estudio de los pathomecanismos. Esta última aplicación se utilizó en el proyecto aquí presente con el fin de crear un modelo de ratón farmacológico para la distonía.
El análisis y la comprensión de los síndromes distónicos, que representan el tercer trastorno de movimiento más común, se han visto muy limitados por el hecho de que los modelos genéticos animales en gran medida no reproducen el fenotipo de la enfermedad que se encuentra en el ser humano enfermo, así como la fisiopatología. Este problema no se limita a los síndromes distónicos, pero de hecho se refiere a muchos modelos de roedores transgénicos en el campo de los trastornos del movimiento1,2. La razón de la falta de un fenotipo en los modelos de roedores transgénicos podría basarse en mecanismos compensatorios altamente eficaces3. En el caso de la distonía, la enfermedad se caracteriza por contracciones musculares involuntarias que causan movimientos de torsión y posturas anormales4. El estudio de las causas secundarias (es decir, lesiones cerebrales) de los síntomas distónicos, ha ayudado a identificar las estructuras implicadas en la manifestación de estas anomalías motoras, como los ganglios basales5. Los estudios de imágenes cerebrales de formas hereditarias de distonía han mostrado anomalías funcionales en casi todas las regiones cerebrales responsables del control motor y la integración sensorial6,,7. Sin embargo, todavía se necesitan modelos de roedores para profundizar la comprensión de las disfunciones neuronales a nivel de red molecular y a gran escala, así como para el desarrollo de opciones terapéuticas. Aquí es donde los modelos farmacológicos de ratón ofrecen la posibilidad de replicar las características clínicas y patológicas de una enfermedad de una manera más precisa.
Distonismo de inicio rápido (DYT/PARK-ATP1A3; RDP; DYT12) es una de las formas hereditarias de distonía. Es causada por mutaciones de pérdida de función en el gen ATP1-3, que codifica para la subunidad de 3 de la Na+/K+-ATPase8. Además, se reconoce que los portadores de mutaciones genéticas pueden estar libres de síntomas durante años antes de desarrollar agudamente distonía generalizada persistente y Parkinson después de la exposición a un evento estresante. De hecho, la penetración de DYT/PARK-ATP1A3 es incompleta y eventos estresantes que actúan como un rango desencadenante desde el sobreesfuerto físico y las temperaturas extremas hasta el consumo excesivo de alcohol e infecciones9,,10. Con el fin de estudiar DYT/PARK-ATP1A3 y encontrar posibles intervenciones terapéuticas, se ha intentado numerosas veces imitar el desarrollo de la enfermedad dependiente del estrés en modelos de roedores. Sin embargo, aparte del modelo genético existente de ratón DYT/PARK-ATP1A3, donde los movimientos transitorios anormales y convulsionados fueron inducidos por hipotermia, todos los modelos de ratón genético publicados para DYT/PARK-ATP1A3 no han podido producir síntomas dónicos1,,11,,12. Antes, Calderón y otros demostraron que el bloqueo bilateral de la subunidad 3 en los ganglios basales y el cerebelo a través del glucósido cardíaco ouabain en ratones de tipo salvaje resulta en una alteración leve de la marcha13. La exposición adicional a las descargas eléctricas del pie en un ambiente cálido condujo a un fenotipo dismónico y bradicinético, lo que demuestra que la perfusión crónica y dirigida de ouabain seguida de estrés imita con éxito el fenotipo DYT/PARK-ATP1A3.
Sin embargo, exponer a los animales a descargas eléctricas en los pies en un ambiente cálido de 38-40 oC durante un período de dos horas induce dolor y ansiedad en los animales, que representan factores confusos, especialmente para la evaluación de los cambios en el sistema de catecolaminas relacionados con el desarrollo de la distonía. Por lo tanto, aquí describimos un tipo diferente de paradigma de estrés con alto valor traslacional, que se relaciona con el hecho de que el ejercicio leve a moderado se han descrito como desencadenantes en los pacientes DYT/PARK-ATP1A39. Además, el ejercicio repetitivo es un desencadenante bien conocido para la distonía focal14. Los ratones fueron sometidos repetidamente a desafiantes tareas motoras compuestas por tres descendientes de un poste de madera (“prueba de polo”) y tres corridas en un aparato Rotarod (“prueba de rendimiento de Rotarod”). La colocación de animales en la parte superior de un poste de madera de 50 cm se utilizó para obligar a los animales a descender, el aparato Rotarod fue empleado para someter a los ratones a la actividad forzada colocándolos en una varilla giratoria.
La caracterización del fenotipo motor de un modelo de ratón para la distonía es particularmente difícil debido a la falta de pruebas y puntuaciones predefinidas. Sin embargo, una variación de una evaluación de la discapacidad motora se ha utilizado repetidamente en los últimos años con el fin de evaluar la gravedad y la distribución de los movimientos similares a la distonía en roedores13,,15,,16. Aquí presentamos una versión modificada de la escala de clasificación de distonía, que resultó ser eficaz en la evaluación del fenotipo similar a la distonía de los animales cuando se observa durante un período de tiempo de cuatro minutos. Como segundo método para evaluar los movimientos similares a la distonía, presentamos un sistema de puntuación recientemente desarrollado para la evaluación de movimientos anormales durante una prueba de suspensión de cola. Permite la evaluación de la frecuencia y duración de los movimientos y posturas similares a la distonía de las extremidades delanteras, las extremidades posteriores, así como el tronco.
Este modelo farmacológico farmacológico DYT/PARK-ATP1A3 permite el análisis detallado de los cambios estructurales y neuroquímicos intracerebrales inducidos únicamente por la inhibición de la bomba de iones de sodio-potasio en los ganglios basales y el cerebelo, así como alteraciones relacionadas con la exposición al estrés. En el caso de ratones, se puede implantar por vía subcutánea un máximo de dos bombas osmóticas. Aquí presentamos un método que detalla la administración crónica de fármacos a múltiples estructuras cerebrales mediante la implementación de una doble cánula conectada a un adaptador de bifurcación además de una sola cánula. Esta metodología se puede utilizar para cualquier aplicación que requiera múltiples estructuras cerebrales para ser perfundido simultáneamente y crónicamente.
Presentamos un modelo de ratón de un trastorno de movimiento raro, donde los pacientes desarrollan síntomas permanentes después de la exposición al estrés. Esta presunta interacción genético-ambiental todavía no se entiende bien, pero podría representar uno de los pathomecanismos clave en el desarrollo de DYT/PARK-ATP1A3. En el pasado se han publicado diferentes métodos de exposición de ratones al estrés que incluyen descargas eléctricas de pies, retención, ambiente frío o cálido y exposición a diversos olores11,,12,,13. En un esfuerzo por exponer a los ratones a un factor de estrés leve con valor traslacional, aquí describimos la sujeción repetitiva de ratones a tareas motoras desafiantes. Para la prueba de polos, los animales perfundidos con ouabain revelaron hiperextensión involuntaria de extremidades delanteras y extremidades traseras. Estos movimientos fueron muy similares a los movimientos similares a la distonía observados durante la grabación de vídeo de 4 minutos de los animales, así como la prueba de suspensión de la cola. La aplicación de estrés leve en forma de tareas motoras desafiantes podría resultar útil en otros modelos de ratón que muestran síntomas motores o neurodegeneración, donde las interacciones genoambien influyen masivamente en el grado de progresión de la enfermedad.
Hay una falta general de tareas de comportamiento predefinidas, así como escalas de clasificación para clasificar movimientos y posturas anormales en ratones. La mayoría de las tareas motoras disponibles revelan anomalías inespecíficas, como el cierre de la extremidad posterior, que es un fenómeno bien conocido en muchos modelos de ratón de trastornos del movimiento con neurodegeneración18,19. Sin embargo, para la caracterización adecuada de un fenotipo, es necesario analizar si el modelo de ratón recapitula las características más destacadas de la enfermedad. Aquí, presentamos la versión modificada de una escala de clasificación de distonía utilizada anteriormente para la evaluación de la discapacidad motora en los modelos de ratón de distonía15,,16. Además, desarrollamos un sistema de puntuación basado en observadores para la prueba de suspensión de cola, que se estableció de forma similar a las escalas de clasificación clínica de la distonía humana. Ambas escalas de clasificación muestran una puntuación significativamente más alta en ratones con infusifundidos con ouabain, estresados en comparación con los animales perfusores de ouabain, así como los animales con perfumo de vehículo. Los inconvenientes de cualquier sistema de puntuación basado en observadores son la formación necesaria de los calificadores para garantizar una puntuación coherente y reducir la variabilidad de los observadores, así como el peligro de un posible sesgo del calificador si no está completamente cegado al grupo analizado. Sin embargo, los sistemas de puntuación basados en observadores todavía presentan un método de fácil acceso para caracterizar un fenotipo y se pueden adaptar al modelo de ratón analizado, como se hace en el presente proyecto para la evaluación de movimientos similares a la distonía. Para garantizar una puntuación coherente entre los diferentes calificadores, los videos de capacitación deben estar disponibles. Para reducir cualquier sesgo potencial, se recomienda que los diferentes calificadores puntúan los mismos clips de vídeo y que se promedian las puntuaciones individuales. Ambos sistemas de puntuación mencionados en este trabajo registran la presencia de movimientos similares a la distonía en animales. Las escalas de clasificación se pueden adaptar de acuerdo con los requisitos específicos dentro de un proyecto, como se hizo anteriormente por Ip et al., donde únicamente las extremidades posteriores se puntuaron para movimientos similares a la distonía en un modelo de ratón para distonía 1 (DYT-TOR1A)20. Las escalas de clasificación pueden complementarse con otros sistemas de puntuación publicados anteriormente, evaluando, por ejemplo, el grado de bradiquinesia en roedores como se hace con la puntuación de discapacidad de la locomoción por Calderón et al.13.
The authors have nothing to disclose.
Este trabajo fue apoyado por el Ministerio Federal de Educación e Investigación (BMBF DysTract to C.W.I.) y por el Centro Interdisciplinario de Investigación Clínica (IZKF) de la Universidad de Wurzburgo (Z2-CSP3 a L.R.). Los autores agradecen a Louisa Frie, Keali Róhm, Veronika Senger y Heike Menzel y por su asistencia técnica, así como a Helga Brinner para el cuidado de los animales.
0.9% saline | Fresenius Kabi | PZN06178437 | |
Alzet osmotic pumps | Durect | 4317 | model 1002, flowrate 0.25 μL/h |
Anchor Screws | AgnTho's | MCS1x2 | 2 mm long with a thread of 1mm O.D. |
Bulldog Clamps | Agntho's | 13-320-035 | straight, 3.5 cm |
Bupivacain 0.25% Jenapharm | mibe GmbH Arzneimittel | ||
Cannula and Minipump Holder | Stoelting | 51636 | designed to hold 3.4 mm cannula heads |
Cannula Bifurcation | Plastics One | 21Y | custom made |
Cannula tubing | Plastics One | C312VT/PKG | vinyl, 0.69 mm x 1.14 mm |
Dumont #5SF forceps | Fine Science Tools | 11252-00 | fine forceps |
eye cream Bepanthen | Bayer Vital GmbH | ||
Gas Anesthesia Mask for Stereotaxic, Mouse | Stoelting | 56109M | |
Hardened fine scissors | Fine Science Tools | 14090-09 | |
High Speed Rotary Micromotor Kit | Foredom | K.1070-2 | |
Isoflurane CP 1 mL/mL, 250 mL | cp-pharma | 1214 | prescription needed |
Isoflurane System Dräger Vapor 19.3 | Dr. Wilfried Müller GmbH | ||
Kallocryl A/C | Speiko | 1615 | dental cement, liquid |
Kallocryl CPGM rot | Speiko | 1692 | dental cement, red powder |
Mouse and neonates adaptor | Stoelting Co. | 51625 | adaptor for mice for a traditional U-frame |
needle holder | KLS Martin Group | 20-526-14 | |
Non-Rupture Ear Bars and Rubber Tips f/ Mouse Stereotaxic | Stoelting Co. | 51649 | |
Octenisept | Schülke | 118211 | |
Osmotic Pump Connector Cannula for Mice, double | Plastics One | 3280PD-3.0/SPC | 28 Gauge, length 4.0 mm, c/c distance 3.0 mm |
Osmotic Pump Connector Cannula for Mice, single | Plastics One | 3280PM/SPC | 28, Gauge, custom length 3.0 mm |
Ouabain octahydrate 250 mg | Sigma-Aldrich | 03125-250MG | CAUTION: toxic |
Precision balance | Kern & Sohn | PFB 6000-1 | |
Rectal Thermal Probe | Stoelting | 50304 | |
Rimadyl 50 mg/mL, injectable | Zoetis | Carprofen, prescription needed | |
Rodent Warmer X1 with Mouse Heating Pad | Stoelting | 53800M | |
RotaRod Advanced | TSE Systems | ||
screw driver set | Agntho's | 30090-6 | |
Stainless Steel Burrs | Agntho's | HM71009 | 0.9 mm Ø burr |
Stainless Steel Burrs | Agntho's | HM71014 | 1.4 mm Ø burr |
StereoDrive | Neurostar | software | |
Stereotaxic instrument | Stoelting Co. | custom made by Neurostar | |
Stereotaxic robot | Neurostar | ||
suture: coated vicryl, polyglatin 910 | Ethicon | V797D | |
ThermoMixer C | Eppendorf AG | 5382000015 |