Имплантация Осмотических насосов и индукция стресса для создания симптоматической, фармакологической модели мыши для ДИТ/ПАРК-ATP1A3 Дистония

Все процедуры были выполнены в соответствии с применимыми международными, национальными и/или институциональными руководящими принципами по уходу и использованию животных. Местные власти в Regierung фон Unterfranken, Вюрцбург, Германия, одобрили все эксперименты на животных. 1. Грунт осмотических насосов ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг должен быть выполнен по крайней мере 48 ч до операции. Осмотические насосы АЛЗЕТ должны быть предварительно заполнены для того, чтобы скорость перекачки достигла стабильного состояния перед имплантацией. Заранее подготовье желаемого раствора для хронической перфузии. Убедитесь, что растворитель и агент совместимы с осмотическими насосами и катетерами. Для проекта в настоящем случае, оттепель 10x фондовый раствор уабаина (хранится при -20 градусов по Цельсию) при комнатной температуре и вихрь в течение 10 с.ВНИМАНИЕ: Ouabain является токсичным: он должен быть обработан только с перчатками и открыт только под стерильным капюшоном, чтобы избежать вдыхания. Включите стерильный капюшон; дезинфицировать капот, а также все инструменты и материалы, необходимые, прежде чем положить их под капот. На надеть хирургические перчатки перед обработкой осмотических насосов. Отдельно подготовьем уабаин-раствор, предназначенный для насосов стриатума и мозжечка.ПРИМЕЧАНИЕ: Учту, что концентрация раствора в насосе для стриатума должна быть удвоена по сравнению с концентрацией раствора в насосе, предназначенном для мозжечка. Это связано с тем, что насос для стриатума соединен с двойной канюлей, скорость потока, однако, такая же, как и для насоса мозжечка, который соединен с одной канюлей. Рассчитайте количество раствора, необходимого по следующей формуле:скорость массовой доставки (ko) – скорость доставки объема (я) x концентрация агента в транспортном средстве (Cd)Для настоящего проекта осмотические насосы были загрунтованы и заполнены раствором уабаина с концентрацией 11,2 нг/ч или 0,9% солевым раствором для контрольной группы. Vortex как ouabain решения для 10 с и стерильный фильтр (т.е. 0,22 мкм шприц-конец фильтра) их в отдельные, новые микроцентрифуг трубки, используя различные фильтры для каждого решения. Взвешивание пустых осмотических насосов вместе с модератором потока (около 0,4 г). Заполните шприц 1 мл с 27 G заполнения канюли (желательно с тупым кончиком) со стерильным фильтрованным ouabain-решение или раствор транспортного средства. Получить все пузырьки воздуха из шприца, держать осмотический насос в вертикальном положении, вставить канюлю всю дорогу в насос и медленно заполнить резервуар, пока избыток раствора появляется на вершине (избегайте быстрой заполнения, как это может привести к пузырькам воздуха в насосе). Затем вставьте модератор потока в насос (сверху должно появиться избыточное решение). Вытяните модератор потока (около 5 мм), аккуратно смахите белый фланг ножницами и подключите кусок виниловых труб к модератору потока. Убедитесь, что катетер имеет длину около 2 см, чтобы обеспечить надлежащую подвижность животного. Взвесь заполненный осмотический насос еще раз, чтобы убедиться, что разница в весе между заполненным и пустым насосом соотносяна с ожидаемым весом загруженного раствора.ПРИМЕЧАНИЕ: Для большинства aqueous решений этот вес равен объему в микролитров. Если вес не соответствует ожидаемому объему, воздух может оказаться в ловушке внутри насоса, который необходимо опорожнить и пополнить. Для грунтовки насосов приготовьте две 2 мл микроцентрифуг трубки, одну трубку для стриатума и одну для мозжечка. Погрузите насосы в микроцентрифуговые трубки, заполненные на полпути солевым раствором 0,9%. Не погружать открытый конец катетера. Поместите микроцентрифуг трубки в термоциклер на 48 ч при 37 градусов по Цельсию, чтобы убедиться, что насос достиг стабильной скорости перекачки до имплантации и катетеры предварительно заполнены. 2. Имплантация канюли и осмотического насоса Поместите мышь (мужчина, C57Bl/6N, 11-12 недель) в камеру, предназначенную для ингаляционной анестезии; установить скорость потока изофлюрана до 2-3% и скорость потока кислорода до 2 л/мин. После того, как мышь глубоко анестезируется в соответствии с утвержденными протоколами, побрить верхнюю часть головы животного, спинной шеи и проксимальной трети спины. Поместите животное в стереотаксическую рамку и продолжайте анестезию изофлюраном с помощью маски для анестезии мыши, предназначенной для стереотаксического инструмента (скорость потока изофлюрана 1,5-2%, 2 л/мин кислорода). Используя резиновые наконечники или не разрываемые ушные прутья, зафиксв голову животного в стереотаксической раме, заботясь о том, чтобы голова выровнялась. Чтобы предотвратить переохлаждение, поместите под животное грелку, вставьте зонд прямой температуры и установите температуру до 37 градусов по Цельсию. Защитите глаза животного от высыхания с помощью капли офтальмологической мази на каждом глазу. Нанесите обезболивающее, такое как карпрофен (5 мг/кг массы тела), подкожно перед началом операции. Со шприцем подкожно вводят до 0,2 мл бутивакаина 0,25% и ждут, когда местная анестезия вступят в силу. Тщательно дезинфицировать бритые участки антисептиком, таким как дигидрохлорид октенидин. После тщательной дезинфекции хирургической области, используйте скальпель, чтобы поместить разрез в верхней части головы и использовать ножницы, чтобы продолжить разрез до конечностей. Разоблачить череп с помощью бульдога зажимы и протрите периостеум с стерильным хлопчатобумажным аппликатором. Выровнять ручку или кончик канюли, окрашенные черными чернилами с брегмой и использовать соответствующие координаты, чтобы отметить три точки входа для мозга канюли на черепе (координаты для двусторонних отверстий, необходимых для перфузии базальных ганглиев: передние / задние: 0,74 мм, медиальный/боковой: 1,50 мм (яп. Далее тщательно просверлите отверстия для двойной канюли, предназначенные для базальных ганглиев и одной канюли, предназначенных длямозжечка (рисунок 1A). Просверлите четвертое отверстие для небольшого винта между стриатумом и мозжечок. Этот винт в конечном итоге будет встроен в зубной цемент и обеспечить дополнительное удержание для канюли. Используя тонкие типсы и винт водителя, осторожно ввести винт в небольшое отверстие, пока он твердо закреплен в черепе. Не имплантировать винт слишком глубоко, как это повреждает ткани мозга.ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется продолжать имплантацию осмотического насоса перед вставкой осмотических канюл. Это позволяет избежать причинения каких-либо случайных повреждений канюли при имплантации насосов. Для того, чтобы создать небольшой карман для осмотического насоса с каждой стороны спины животных, используйте ткани force, чтобы отделить слои подкожной ткани. Заранее типсы к одной задней ноге и открыть миппы немного для того, чтобы расширить подкожный карман. Повторите ту же процедуру для другой стороны, сначала удалив типсы из разреза, а затем толкая их осторожно к второй задней ноге.ПРИМЕЧАНИЕ: Карман должен позволить насосу легко скользить, однако, он не должен иметь слишком много места для перемещения под кожей. С помощью тканевых типсов возьмите первый насос вместе с подключенным куском трубки и сдвиньте его в один подкожный карман. Повторите ту же процедуру со вторым насосом. Используя держатель minipump, ввемите один osmotic cannula с изготовленной на заказ длиной 3.0 mm в отверстие просверленное в midline мозжечка. Отсоедините голову канюли тщательно и исправить канюлю, а также небольшой винт с зубным цементом, заботясь, чтобы не покрыть соединительный кусок для труб осмотического насоса. Убедитесь, что зубной цемент, окружающий канюлю, полностью высох, прежде чем продолжить операцию. Перед вставкой двойной канюли с расстоянием от центра до центра 3,0 мм и индивидуальной длиной 4,0 мм в двусторонние пробуренные отверстия над базальными ганглиями прикрепите два коротких куска виниловых труб (0,5 см) к двум соединительным частям двойной канюли. Соедините виниловые трубки с адаптером бифуркации и тщательно заполните всю трубную систему, включая адаптер и канюлю с раствором уабаина или транспортным средством (комнатная температура, стерильная фильтрованная заранее). Это может быть сделано лучше всего с 1 мл шприца и 27 G заполнения канюли введены в одном задней части адаптера бифуркации (Рисунок 1B). Используя держатель minipump, тщательно вставьте двойную канюлю в двусторонние отверстия. Используйте зажим, чтобы отсоединить голову канюлы и исправить двойной канюле с зубным цементом. Подключите катетеры осмотических насосов к адаптеру бифуркации, а также к одной канюле, соответственно. Убедитесь, что катетеры имеют сильную провести на соединительные части канюли.ПРИМЕЧАНИЕ: Оба насоса имеют равную скорость потока, так что будьте осторожны, чтобы соединить осмотический насос с двойным концентрированным раствором для адаптера бифуркации, чтобы гарантировать, что та же концентрация достигает как базальных ганглиев и мозжечка. Закройте разрез на спине животных швами, насколько это возможно в направлении черепа, будьте осторожны, чтобы не перенапряжение кожи(рисунок 1C). Подкожно вводят 0,5 мл 0,9% солевого раствора, который должен иметь температуру тела, в складку кожи с каждой стороны спины животных, чтобы избежать обезвоживания мышей, тщательно избегая насосов. 3. Двигатель вызов Тема ouabain- или транспортного средства проникнуты мышей сложных двигательных задач в качестве одной из форм мягкого воздействия стресса 4 ч после операции и повторяется каждые 24 ч после этого для того, чтобы вызвать дистонии, как движения. Это не включает в себя поведенческую характеристику; его цель состоит в том, чтобы вызвать более высокий уровень стресса по сравнению с нормальным содержанием клетки. Поместите мышь на 50 см грубой поверхности, деревянный столб диаметром 1 см, нос лицом вниз. Убедитесь, что полюс помещается в большую клетку с достаточным количеством постельных принадлежностей в случае падения. Не нужно измерять время спуска, но при спуске с полюса следует присмотреться к непроизвольным гиперэкспер напряжениям передних конечностей и задних конечностей, представленным животными, пропитанными уабаином. Пусть мыши спуститься полюс три раза и позволяют 2 мин восстановления между спусками.ПРИМЕЧАНИЕ: Уабаин проникнуты мышей должны представить первые симптомы, как bradykinesia 4 ч после операции. Тем не менее, 24 ч после операции мышей должны начать представлять непроизвольные гиперэкс напряженности передних конечностей и задних конечностей в знак дистонии, как движения во время спуска. Для выполнения второй моторной задачи поместите мышей на вращающийся стержень, как это было сделано для теста производительности Rotarod. Аппарат Rotarod не используется в качестве меры задержки падения, цель состоит в том, чтобы подвергать мышей принудительной деятельности. Поместите мышей на вращающийся стержень три раза и дайте 2 мин восстановления между тестами.ПРИМЕЧАНИЕ: Для увеличения воздействия стресса используйте ускоряющийся аппарат Rotarod. Для проекта, описанного в настоящем, стержень ускоряется от 5 до 50 об /мин в течение установленного периода времени 300 сек. Пусть животные восстановить в течение 30 минут между полюсом тест и Rotarod производительности теста и снова еще 30 минут, прежде чем забил для дистонии, как движения, как описано в протоколе шаг 4. В промежутках между повторяющимися воздействиями стресса, позволяют мышам восстановиться в течение 24 часов-интервалов. 4. Скоринг системы для оценки дистонии, как движения ПРИМЕЧАНИЕ: Экспериментатор должен быть ослеплен групповым заданием, проанализированным для предотвращения предвзятости. Поведенческие тесты, используемые для характеристики фенотипа мышей две системы скоринга: дистония рейтинговая шкала забил ненормальным, дистония, как движения и поведенческие оценки с помощью теста подвески хвоста. Оцените дистонии, как движения после восстановления время 30 минут после воздействия легкого стресса. Шкала рейтинга ДистонииПРИМЕЧАНИЕ: Из-за отсутствия предопределенных поведенческих задач, шкала рейтинга дистонии была создана в качестве системы скоринга на основе наблюдателей, аналогичной клиническим шкалам рейтингов человеческой дистонии. Это модифицированная версия рейтинговой шкалы дистонии, используемая Calderon et al.13. Запись осанки и походки животных в течение 4 минут после того, как животные были помещены в пластиковый или деревянный ящик. Оценка частоты и распределения дистонии, как движения от 0 до 4 баллов: (0) нормальное поведение двигателя; (1) аномальное моторное поведение, никаких дистония-как движения; (2) легкие двигательные нарушения с легкой фокусной дистонией, как движения; (3) умеренное двигательное нарушение с тяжелыми очаговыми дистониями, как движения; (4) тяжелые нарушения, с устойчивыми, обобщенными дистонией, как движения (Рисунок 2). Рассмотрим следующие движения или позы, как дистония, как: гиперэкстензия передних конечностей, широкая позиция или гиперэкстензия задних конечностей, а также кифоз. Рассмотрим дистонии в качестве координационного в случае, если одна часть тела влияет и как обобщенные в случае ствола и по крайней мере две другие части тела страдают. Испытание подвески хвостаПРИМЕЧАНИЕ: Тест подвески хвоста часто используется для наблюдения и оценки за задний сжимая. Это, однако, весьма неспецифический фенотип, указывающий на двигательные нарушения. Следующий протокол предлагает скоринговую систему, специфичную для дистонийных движений. В связи с обобщением дистонии у пациентов DYT/PARK-ATP1A3, дистония, как движения должны быть оценены в передних конечностях, туловище и задние конечности. Недавно разработанная система подсчета очков от 0-8 баллов была разработана, общий балл Lt; 2 указал, что нет дистонии, как движения присутствовали (Рисунок 3). Возьмите мышь за хвост возле ее основания и поднимите животное вверх. Зафиксируем 2-минутный видео теста на подвеску хвоста и назначьте оценку в последующем тщательном анализе записи. Оценка передних конечностей от 0 до 4 точек, где повторяющиеся или устойчивые тонизирующие опровержения одной или обеих передних конечностей, а также гиперэкстензия в сочетании с пересечением передних конечностей, были классифицированы как дистония,как: (0) никаких ненормальных движений; (1) уменьшенное движение передних конечностей с гиперэкстензией лап видел 50% от записанного времени; (2) мягкие дистонии, как движения передней конечности (ы) Lt; 50% от записанного времени; (3) мягкие дистония, как движения передней конечности (ы) – 50% от записанного времени или тяжелой lt; 50% от записанного времени; (4) тяжелые дистония, как движения передней конечности (ы) 50% от записанного времени.ПРИМЕЧАНИЕ: Hindlimb сжимая является ненормальным движением, которое не должно быть забил, как дистония-как. Оценка задних конечностей от 0 до 3 баллов, где опровержение и сжатие задних конечностей, а также устойчивые гиперэкстензии были оценены как дистония-как: (0) никаких ненормальных движений; (1) уменьшенное движение задних конечностей с гиперэкстензией лап видел 50% от записанного времени; (2) дистония, как движения одного хиндлимба; (3) дистония, как движения обеих задних конечностей. В случае truncal искажения 80% записанного времени, дополнительное очко добавляется к счету. Поместите животное обратно в клетку.