DYT/PARK-ATP1A3 Distonisi Için Semptomatik, Farmakolojik Fare Modeli Kurmak için Osmotik Pompaların İmplantasyonu ve StresIn İndüksiyonu
Summary
Osmotik pompalara bağlı bazal ganglia ve serebelluma kanüllerin implantasyonu yoluyla farmakolojik DYT/PARK-ATP1A3 distoni fare modeli oluşturmak için bir protokol salıyoruz. Distopya benzeri hareketlerin indüksiyonunu bir motor meydan okuma uygulaması ve fenotipin davranışsal skorlama sistemleri ile karakterizasyonu ile tanımlarız.
Abstract
Genetiği değiştirilmiş fare modelleri, özellikle mevcut transgenik kemirgen modellerinin çoğunun insan hastalığının klinik yönlerini andıran bir motor fenotip sunmuyorhareket bozuklukları incelerken sınırlamalarla karşı karşıyadır. Farmakolojik fare modelleri patomekanizmaların ve bunların davranışsal fenotip üzerindeki etkilerinin daha doğrudan incelenmesine olanak sağlar. Beyin kanüllerine bağlı ozmotik pompalar, lokal ve kronik ilaç dağıtımı yoluyla farmakolojik fare modelleri oluşturma olasılığını ortaya çıkar. Hızlı başlangıçlı distoni-parkinsonizmin kalıtsal hareket bozukluğu için, Na+/K+-ATPaz’ın α3-alt ünitesindeki fonksiyon kaybı mutasyonu glikozit ouabain yoluyla son derece spesifik bir abluka ile simüle edilebilir. Hızlı başlangıçlı distoni-parkinsonizmpatogenezinde yoğun rol yaptığı düşünülen iki beyin yapısı olan bazal gangliyon ve beyincikteki α3-alt ünitesini lokal olarak bloke etmek için, bilateral bir kanül stereotaksik olarak striatuma yerleştirilir ve beyincik içine ek bir kanül yerleştirilir. Kanüller hayvanların arkasına deri altı implante edilen ve ouabain kronik ve hassas teslim için izin iki ozmotik pompalar, vinil tüp ile bağlanır. Hızlı başlangıçlı distoni-parkinsonizm için farmakolojik fare modeli, asemptomatik ve semptomatik mutasyon taşıyıcılarının klinik ve patolojik özelliklerini yeniden formüle etme avantajını taşır. Hızlı başlangıçlı distoni parkinsonizmmutasyon taşıyıcıları gibi, ouabain perfüzyon fareler sadece strese ek maruz kaldıktan sonra distoni benzeri hareketler geliştirmek. Biz hafif bir stres paradigması göstermek ve bir motor fenotip değerlendirilmesi için iki modifiye skorlama sistemleri tanıtmak.
Introduction
Doğrudan beyne sürekli bir ilaç teslim avantajları çoktur. Hayvanlar için gereksiz bir stres faktörünü temsil eden tekrarlayan ve sık enjeksiyonlardan kaçınılabilir ve ilacın daha sabit bir intraserebral konsantrasyonu sağlanabilir. Bu özellikle sistemik olarak uygulanan ilaçlar kolayca kan beyin bariyerini nüfuz başarısız geçerlidir. Ayrıca, ozmotik pompalar aracılığıyla kronik ilaç teslim aksi takdirde sistem çapında yan etkileri olurdu substratların lokalize teslimat için izin verir. İlaçlar istenilen beyin yapılarına hedefli bir şekilde teslim edilebilir, ortaya çıkan etkisi böylece doğrudan izlenebilir. Bu, terapötik etkilerin incelenmesi ve patomekanizmaların incelenmesi gibi bir dizi uygulama için kullanılabilir. Bu son uygulama distoni için farmakolojik bir fare modeli oluşturmak amacıyla burada projede kullanılmıştır.
Üçüncü en yaygın hareket bozukluğunu temsil eden distonik sendromların analizi ve anlaşılması, genetik hayvan modellerinin hastalıklı insanda bulunan hastalık fenotipinin yanı sıra patofizyolojiyi yeniden üretememesi ile büyük ölçüde sınırlandırılmıştır. Bu sorun disttonik sendromlar ile sınırlı değildir, ama aslında hareket bozuklukları alanında birçok transgenik kemirgen modelleri ile ilgilidir1,2. Transgenik kemirgen modellerde fenotip eksikliğinin nedeni son derece etkili telafi mekanizmalarına dayanıyor olabilir3. Distoni durumunda, hastalık büküm hareketleri ve anormal duruşlar neden istemsiz kas kasılmaları ile karakterizedir4. Distonik semptomların ikincil nedenler (yani beyin hasarı) çalışması, bazal ganglia5gibi bu motor anormalliklerin tezahürü ile ilgili yapıların belirlenmesine yardımcı oldu. Distoninin kalıtsal formlarının beyin görüntüleme çalışmaları motor kontrol ve sensorimotor entegrasyonu sorumlu hemen hemen tüm beyin bölgelerinde fonksiyonel anormallikler göstermiştir6,7. Ancak, kemirgen modelleri hala moleküler ve büyük ölçekli ağ düzeyinde nöral disfonksiyonlar anlayışını derinleştirmek için yanı sıra terapötik seçeneklerin geliştirilmesi için gereklidir. Farmakolojik fare modellerinin bir hastalığın klinik ve patolojik özelliklerini daha kesin bir şekilde kopyalama olanağı sunduğu yer burasıdır.
Hızlı başlangıçlı distoni-parkinsonizm (DYT/PARK-ATP1A3; RDP; DYT12) distoninin kalıtsal formlarından biridir. Na+/K+ -ATPase8’inα3-alt birimini kodlayan ATP1α3 genindeki fonksiyon kaybı mutasyonlarından kaynaklanır. Ayrıca, gen mutasyonu taşıyıcılarının stresli bir olaya maruz kaldıktan sonra akut olarak kalıcı yaygın distoni ve Parkinsonizm gelişmeden önce yıllarca semptomlardan arınmış olabileceği kabul edilmektedir. Nitekim, DYT / PARK-ATP1A3 penetratif eksik ve stresli olaylar alkol ve enfeksiyonların aşırı tüketimi fiziksel aşırı efor ve aşırı sıcaklıklardan bir tetikleyici aralığı olarak hareket eden9,10. DYT/PARK-ATP1A3’ü incelemek ve potansiyel terapötik müdahaleleri bulmak için kemirgen modellerinde strese bağlı hastalık gelişimini taklit etmek defalarca denenmiştir. Ancak, bir kenara bir mevcut genetik DYT / PARK-ATP1A3 fare modeli, burada geçici anormal ve konvülsiyon benzeri hareketleri hipotermi tarafından indüklenen, DYT / PARK-ATP1A3 için tüm yayınlanan genetik fare modelleri distonik belirtiler üretmek için başarısız oldu1,11,12. Calderon ve ark. daha önce göstermiştir ki, yabani tip farelerde kardiyak glikozit ouabain ile bazal gangliyonlarda ve beyincikte α3-alt ünitenin iki taraflı olarak bloke olması hafif yürüyüş bozukluğuna yol açarak13. Sıcak bir ortamda elektrik ayak şoklarına ek maruz kalma bir distonik ve bradikinetik fenotip yol açtı, böylece stres takip ouabain kronik ve hedefli perfüzyon başarıyla DYT / PARK-ATP1A3 fenotip taklit gösteren.
Ancak hayvanların iki saatlik bir süre boyunca 38-40 °C sıcak bir ortamda elektrik ayak şoklarına maruz kalmaları hayvanlarda ağrı ve endişeye neden olur ve bu da özellikle distoni gelişimine bağlı katekolamin sistemindeki değişikliklerin değerlendirilmesi nde şaşırtıcı faktörlere yol açmaktadır. Böylece, burada dyt/ PARK-ATP1A3 hastalarda tetikleyiciolarak hafif ve orta egzersiz olarak tarif edilmiştir gerçeğine geri ilgilidir yüksek çevirideğeri ile stres paradigması farklı bir tür açıklar9. Ayrıca, tekrarlayan egzersiz fokal distoni için iyi bilinen bir tetikleyici dir14. Fareler, bir tahta direğin üç inme (“kutup testi”) ve rotarod aygıtı (“Rotarod performans testi”) üzerinde üç koşudan oluşan zorlu motor görevlere maruz kaldılar. Hayvanların 50 cm’lik ahşap direğin üstüne yerleştirilmesi hayvanları alçalmaya zorlamak için kullanılırken, Rotarod cihazı fareleri döner bir çubuk üzerine yerleştirerek zorla aktiviteye tabi tutulmak için kullanıldı.
Bir fare modelinin distoni için motor fenotipinin karakterizasyonu, önceden tanımlanmış testlerin ve skorların eksikliği nedeniyle özellikle zordur. Ancak, bir motor sakatlık değerlendirme bir varyasyon tekrar tekrar son yıllarda şiddeti ve kemirgenler13,15,,16distoni benzeri hareketlerin dağılımı nı değerlendirmek için kullanılmıştır. Burada distoni derecelendirme ölçeğinin değiştirilmiş bir versiyonunu salıyoruz, bu da dört dakikalık bir süre boyunca gözlendiğinde hayvanların distoni benzeri fenotipinin değerlendirilmesinde etkili olduğunu kanıtladı. Distoni benzeri hareketleri değerlendirmenin ikinci bir yöntemi olarak, kuyruk süspansiyon testi sırasında anormal hareketlerin değerlendirilmesi için yeni geliştirilmiş bir skorlama sistemi salıyoruz. Bu sıklık ve distoni benzeri hareketler ve ön ekstremite, arka bacaklar yanı sıra gövde duruşlarının süresinin değerlendirilmesi için izin verir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu DYT/PARK-ATP1A3 farmakolojik fare modeli, sadece bazal gangliyon ve serebellumdaki sodyum-potasyum iyon pompasının inhibisyonu ve strese maruz kalma ile ilgili değişiklikler le intihal ile indüklenen intraserebral yapısal ve nörokimyasal değişikliklerin ayrıntılı analizini sağlar. Farelerde en fazla iki ozmotik pompa subkutan olarak implante edilebilir. Burada, tek bir kanüle ek olarak çataldan külasyon adaptöre bağlı çift kanül uygulayarak birden fazla beyin yapısına kronik ilaç teslimatını ayrıntılı olarak anlatan bir yöntem salıyoruz. Bu metodoloji aynı anda ve kronik olarak birden fazla beyin yapısının perfüzyon gerektiren herhangi bir uygulama için kullanılabilir.
Biz nadir bir hareket bozukluğu bir fare modeli salıyoruz, hastaların strese maruz kaldıktan sonra kalıcı belirtiler geliştirmek nerede. Bu tahmin gen-çevre etkileşimi hala iyi anlaşılamamıştır, ancak DYT/PARK-ATP1A3 gelişimindeki temel patomekanizmalarından birini temsil edebilir. Farelerin strese maruz kalmanın farklı yöntemleri geçmişte yayınlanmıştır ve elektrik ayak şokları, kısıtlama, soğuk veya sıcak ortam ve çeşitli kokulara maruz kalma11,12,13. Fareleri çeviri değeri olan hafif bir stres faktörüne maruz bırakmak amacıyla, farelerin zorlu motor görevlere tekrarlayan öznel öznelliğini burada açıklıyoruz. Kutup testi için, ouabain perfüzyon hayvanlar ön ekstremite ve arka bacaklar istemsiz hiperuzantısı ortaya. Bu hareketler, hayvanların 4 dakikalık video kaydı ve kuyruk süspansiyon testi sırasında gözlenen distoni benzeri hareketlere çok benziyordu. Zorlu motor görevler şeklinde hafif stres uygulanması motor belirtileri veya nörodejenerasyon gösteren diğer fare modellerinde yararlı olabilir, gen-çevresel etkileşimleri büyük ölçüde hastalığın ilerleme derecesini etkileyen nerede.
Farelerde anormal hareketleri ve duruşları sınıflandırmak için önceden tanımlanmış davranış görevlerinin yanı sıra derecelendirme ölçeklerinde genel bir eksiklik vardır. Mevcut motor görevlerin çoğu nörodejenerasyon ile hareket bozukluklarının birçok fare modellerinde iyi bilinen bir fenomen olan hindlimb clasping gibi, spesifik olmayan anormallikler ortaya18,19. Bir fenotipin doğru karakterizasyonu için, fare modelinin hastalığın belirgin özelliklerini özetleyip özetlemediğini analiz etmek gerekir. Burada, distoni fare modellerinde motor özürlülük değerlendirmesi için daha önce kullanılan bir distoni derecelendirme ölçeğinin değiştirilmiş sürümünü salıyoruz15,16. Ayrıca kuyruk süspansiyon testi için insan distonisinin klinik derecelendirme ölçeklerine benzer şekilde kurulmuş gözlemci tabanlı bir skorlama sistemi geliştirdik. Her iki derecelendirme ölçekleri ouabain perfüzyon, stresli fareler ouabain perfüzyon, stresli olmayan hayvanların yanı sıra araç perfüzyon hayvanlara göre önemli ölçüde daha yüksek bir puan göstermektedir. Herhangi bir gözlemci tabanlı puanlama sisteminin sakıncaları, tutarlı puanlama sağlamak ve gözlemci değişkenliğini azaltmak ve analiz edilen gruba tamamen kör değilse, orantörün olası bir önyargısı tehlikesini azaltmak için gerekli eğitimlerdir. Ancak, gözlemci tabanlı puanlama sistemleri hala bir fenotip karakterize etmek için kolay erişilebilir bir yöntem mevcut ve analiz fare modeli adapte edilebilir, distoni benzeri hareketlerin değerlendirilmesi için mevcut projede yapıldığı gibi. Farklı puanlayıcılar arasında tutarlı puanlama sağlamak için, eğitim videoları kullanılabilir yapılmalıdır. Herhangi bir potansiyel önyargıyı azaltmak için, farklı puanlayıcıların aynı video klipleri puanlaması ve tek tek puanların ortalaması nın olması önerilir. Bu çalışmada bahsedilen her iki skorlama sistemi hayvanlarda distoni benzeri hareketlerin varlığını kaydeder. Derecelendirme ölçekleri, daha önce Ip ve ark.’nın yaptığı gibi, bir projedeki özel gereksinimlere göre uyarlanabilir, burada distoni 1 (DYT-TOR1A)20için bir fare modelinde distoni benzeri hareketler için sadece arka bacaklar puanlanmıştır. Derecelendirme ölçekleri diğer daha önce yayınlanmış puanlama sistemleri ile tamamlanabilir, örneğin kemirgenlerde bradikinezi derecesini değerlendiren Calderon ve ark.13tarafından locomotion sakatlık puanı ile yapılır .
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma Federal Eğitim ve Araştırma Bakanlığı (BMBF DysTract to C.W.I.) ve Würzburg Üniversitesi’ndeki Disiplinlerarası Klinik Araştırma Merkezi (IZKF) (Z2-CSP3’ten L.R.’a) tarafından desteklenmiştir. Yazarlar Louisa Frieß, Keali Röhm, Veronika Senger ve Heike Menzel’e ve teknik yardımları için helga Brünner’e hayvan bakımı için teşekkür eder.
Materials
| 0.9% saline | Fresenius Kabi | PZN06178437 | |
| Alzet osmotic pumps | Durect | 4317 | model 1002, flowrate 0.25 μL/h |
| Anchor Screws | AgnTho's | MCS1x2 | 2 mm long with a thread of 1mm O.D. |
| Bulldog Clamps | Agntho's | 13-320-035 | straight, 3.5 cm |
| Bupivacain 0.25% Jenapharm | mibe GmbH Arzneimittel | ||
| Cannula and Minipump Holder | Stoelting | 51636 | designed to hold 3.4 mm cannula heads |
| Cannula Bifurcation | Plastics One | 21Y | custom made |
| Cannula tubing | Plastics One | C312VT/PKG | vinyl, 0.69 mm x 1.14 mm |
| Dumont #5SF forceps | Fine Science Tools | 11252-00 | fine forceps |
| eye cream Bepanthen | Bayer Vital GmbH | ||
| Gas Anesthesia Mask for Stereotaxic, Mouse | Stoelting | 56109M | |
| Hardened fine scissors | Fine Science Tools | 14090-09 | |
| High Speed Rotary Micromotor Kit | Foredom | K.1070-2 | |
| Isoflurane CP 1 mL/mL, 250 mL | cp-pharma | 1214 | prescription needed |
| Isoflurane System Dräger Vapor 19.3 | Dr. Wilfried Müller GmbH | ||
| Kallocryl A/C | Speiko | 1615 | dental cement, liquid |
| Kallocryl CPGM rot | Speiko | 1692 | dental cement, red powder |
| Mouse and neonates adaptor | Stoelting Co. | 51625 | adaptor for mice for a traditional U-frame |
| needle holder | KLS Martin Group | 20-526-14 | |
| Non-Rupture Ear Bars and Rubber Tips f/ Mouse Stereotaxic | Stoelting Co. | 51649 | |
| Octenisept | Schülke | 118211 | |
| Osmotic Pump Connector Cannula for Mice, double | Plastics One | 3280PD-3.0/SPC | 28 Gauge, length 4.0 mm, c/c distance 3.0 mm |
| Osmotic Pump Connector Cannula for Mice, single | Plastics One | 3280PM/SPC | 28, Gauge, custom length 3.0 mm |
| Ouabain octahydrate 250 mg | Sigma-Aldrich | 03125-250MG | CAUTION: toxic |
| Precision balance | Kern & Sohn | PFB 6000-1 | |
| Rectal Thermal Probe | Stoelting | 50304 | |
| Rimadyl 50 mg/mL, injectable | Zoetis | Carprofen, prescription needed | |
| Rodent Warmer X1 with Mouse Heating Pad | Stoelting | 53800M | |
| RotaRod Advanced | TSE Systems | ||
| screw driver set | Agntho's | 30090-6 | |
| Stainless Steel Burrs | Agntho's | HM71009 | 0.9 mm Ø burr |
| Stainless Steel Burrs | Agntho's | HM71014 | 1.4 mm Ø burr |
| StereoDrive | Neurostar | software | |
| Stereotaxic instrument | Stoelting Co. | custom made by Neurostar | |
| Stereotaxic robot | Neurostar | ||
| suture: coated vicryl, polyglatin 910 | Ethicon | V797D | |
| ThermoMixer C | Eppendorf AG | 5382000015 |
Riferimenti
- DeAndrade, M. P., Yokoi, F., van Groen, T., Lingrel, J. B., Li, Y. Characterization of Atp1a3 mutant mice as a model of rapid-onset dystonia with parkinsonism. Behavioural Brain Research. 216 (2), 659-665 (2011).
- Dang, M. T., et al. Generation and characterization of Dyt1 DeltaGAG knock-in mouse as a model for early-onset dystonia. Experimental Neurology. 196 (2), 452-463 (2005).
- Kreiner, G. Compensatory mechanisms in genetic models of neurodegeneration: are the mice better than humans. Frontiers in Cellular Neuroscience. 9, 56 (2015).
- Albanese, A., et al. Phenomenology and classification of dystonia: a consensus update. Movement Disorders. 28 (7), 863-873 (2013).
- Marsden, C. D., Obeso, J. A., Zarranz, J. J., Lang, A. E. The anatomical basis of symptomatic hemidystonia. Brain. 108, 463-483 (1985).
- Carbon, M., et al. Increased sensorimotor network activity in DYT1 dystonia: a functional imaging study. Brain. 133, 690-700 (2010).
- Carbon, M., Su, S., Dhawan, V., Raymond, D., Bressman, S., Eidelberg, D. Regional metabolism in primary torsion dystonia: effects of penetrance and genotype. Neurology. 62 (8), 1384-1390 (2004).
- de Carvalho Aguiar, P., et al. Mutations in the Na+/K+ -ATPase alpha3 gene ATP1A3 are associated with rapid-onset dystonia parkinsonism. Neuron. 43 (2), 169-175 (2004).
- Brashear, A., et al. The phenotypic spectrum of rapid-onset dystonia-parkinsonism (RDP) and mutations in the ATP1A3 gene. Brain. 130 (3), 828-835 (2007).
- Barbano, R. L., et al. New triggers and non-motor findings in a family with rapid-onset dystonia-parkinsonism. Parkinsonism & Related Disorders. 18 (6), 737-741 (2012).
- Isaksen, T. J., et al. Hypothermia-induced dystonia and abnormal cerebellar activity in a mouse model with a single disease-mutation in the sodium-potassium pump. PLOS Genetics. 13 (5), 1006763 (2017).
- Sugimoto, H., Ikeda, K., Kawakami, K. Heterozygous mice deficient in Atp1a3 exhibit motor deficits by chronic restraint stress. Behavioural Brain Research. 272, 100-110 (2014).
- Calderon, D. P., Fremont, R., Kraenzlin, F., Khodakhah, K. The neural substrates of rapid-onset Dystonia-Parkinsonism. Nature Neuroscience. 14 (3), 357-365 (2011).
- Cutsforth-Gregory, J. K., et al. Repetitive exercise dystonia: A difficult to treat hazard of runner and non-runner athletes. Parkinsonism & Related Disorders. 27, 74-80 (2016).
- Pizoli, C. E., Jinnah, H. A., Billingsley, M. L., Hess, E. J. Abnormal Cerebellar Signaling Induces Dystonia in Mice. The Journal of Neuroscience. 22 (17), 7825-7833 (2002).
- Jinnah, H. A., et al. Calcium channel agonists and dystonia in the mouse. Movement Disorders. 15 (3), 542-551 (2000).
- Rauschenberger, L., Knorr, S., Al-Zuraiqi, Y., Tovote, P., Volkmann, J., Ip, C. W. Striatal dopaminergic dysregulation and dystonia-like movements induced by sensorimotor stress in a pharmacological mouse model of rapid-onset dystonia-parkinsonism. Experimental Neurology. 323, 113109 (2020).
- Fernagut, P. O., Diguet, E., Bioulac, B., Tison, F. MPTP potentiates 3-nitropropionic acid-induced striatal damage in mice: reference to striatonigral degeneration. Experimental Neurology. 185 (1), 47-62 (2004).
- Guyenet, S. J., et al. A simple composite phenotype scoring system for evaluating mouse models of cerebellar ataxia. Journal of Visualized Experiments. 39, 1787 (2010).
- Ip, C. W., et al. Tor1a+/- mice develop dystonia-like movements via a striatal dopaminergic dysregulation triggered by peripheral nerve injury. Acta Neuropathologica Communications. 4, 108 (2016).
