संयुक्त अग्रदूत आइसोटोपिक लेबलिंग और आइसोबोरिक टैगिंग (सीपीपाइट) एक बढ़ी हुई नमूना मल्टीप्लेक्सिंग रणनीति है जो नमूनों की संख्या बढ़ाने में सक्षम है जिसका एक साथ उपलब्ध आइसोकरिक टैग के साथ विश्लेषण किया जा सकता है। रोबोटिक प्लेटफॉर्म के समावेश ने प्रयोगात्मक थ्रूपुट, प्रजनन क्षमता और मात्रात्मक सटीकता में काफी वृद्धि की है।
हमने एक उच्च थ्रूपुट क्वांटिटेटिव प्रोटेओमिक्स वर्कफ्लो, संयुक्त अग्रदूत आइसोटोपिक लेबलिंग और आइसोकरिक टैगिंग (सीपीआईएलटी) को एक ही प्रयोग में क्रमशः टैंडेम मास टैग या आइसोकरिक एन, एन-डिमेथाइल ल्यूकिन आइसोबोरिक टैग्स के साथ 22 या 24 नमूनों तक मल्टीप्लेक्सिंग करने में सक्षम पेश किया है। यह बढ़ाया नमूना मल्टीप्लेक्सिंग बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोमेट्री अधिग्रहण समय को कम करता है और महंगे वाणिज्यिक आइसोबेटर रिएजेंट्स की उपयोगिता को बढ़ाता है। हालांकि, रणनीति में नमूना हैंडलिंग और पाइपिंग चरणों की मैनुअल प्रक्रिया श्रम गहन, समय लेने वाली हो सकती है, और नमूना हानि और मात्रात्मक त्रुटि पेश कर सकती है। इन सीमाओं को स्वचालन के समावेश के माध्यम से दूर किया जा सकता है। यहां हमने मैनुअल cPILOT प्रोटोकॉल को एक स्वचालित तरल हैंडलिंग डिवाइस में स्थानांतरित कर दिया जो समानांतर रूप से बड़े नमूना संख्या (यानी, 96 नमूने) तैयार कर सकता है। कुल मिलाकर, स्वचालन सीपीआईलॉट की व्यवहार्यता और प्रजनन क्षमता को बढ़ाता है और तुलनीय स्वचालन उपकरणों के साथ अन्य शोधकर्ताओं द्वारा व्यापक उपयोग की अनुमति देता है।
मास स्पेक्ट्रोमेट्री (एमएस) आधारित प्रोटेओमिक्स रोग विशिष्ट बायोमार्कर की पहचान करने, रोग प्रगति को समझने और चिकित्सीय विकास के लिए लीड बनाने में एक अनिवार्य अनुसंधान उपकरण है। यह रोग से संबंधित नैदानिक नमूनों जैसे रक्त सीरम/प्लाज्मा, समीपस्थ तरल पदार्थ, और ऊतकों1, 2की एक श्रृंखला से प्राप्त किया जासकताहै । नमूना मल्टीप्लेक्सिंग रणनीतियों की शक्ति के कारण प्रोटेओमिक्स बायोमार्कर खोज और सत्यापन को हाल ही में महत्वपूर्ण रूप से ध्यान में रखा गया है3,4. नमूना मल्टीप्लेक्सिंग एक ऐसी तकनीक है जो एक एमएस इंजेक्शन5,6के भीतर दो या अधिक नमूना स्थितियों की एक साथ तुलना और मात्राकरण को सक्षम बनाती है । नमूना मल्टीप्लेक्सिंग को रासायनिक, एंजाइमेटिक या मेटाबोलिक टैग के साथ कई नमूनों से पेप्टाइड्स या प्रोटीन को बार्कोडिंग करके प्राप्त किया जाता है और एक ही एमएस या एमएस/एमएस प्रयोग में सभी नमूनों से एमएस जानकारी प्राप्त की जाती है । उपलब्ध आइसोकरिक टैग में आइसोकरिक टैगिंग रिएजेंट्स (iTRAQ), वाणिज्यिक टैंडेम मास टैग (टीएमटी), और घर संश्लेषित आइसोकरिक एन, एन-डिमेथाइल ल्यूसिन (DiLeu) क्रमशः 16-प्लेक्स7 और 21-प्लेक्स8तक की क्षमताओं के साथ रिएजेंट हैं।
संयुक्त अग्रदूत आइसोटोपिक लेबलिंग और आइसोबोरिक टैगिंग (cPILOT) एक उन्नत नमूना मल्टीप्लेक्सिंग तकनीक है। CPILOT पेप्टाइड एन-टर्मिनी के आइसोटोपिक लेबलिंग को प्रकाश [−(सीएच3)2]और भारी [−13 सी2एच3)2]कम पीएच (∼2.5) परआइसोटोप के साथ जोड़ती है, जो बाद में उच्च पीएच (8.5) के लिए lysine अवशेष उपलब्ध रखती है, टीएमटी का उपयोग कर रही है। DiLeu, या iTRAQ टैगिंग3,9,10,11,12,13,14। सीपीपायलट रणनीति की दोहरी लेबलिंग योजना को पूरक चित्रा 1 में दर्शाया गया है जिसमें एक उदाहरण पेप्टाइड का उपयोग करके दो नमूने हैं। एमएस2 स्तर पर टीएमटी आधारित मात्राकरण की सटीकता और सटीकता को दूषित सह-पृथक और सह-खंडित आयनों की उपस्थिति के कारण समझौता किया जा सकता है जिसे हस्तक्षेप प्रभाव15कहा जाता है। गलत रिपोर्टर आयन अनुपात में इस सीमा को ट्राइब्रिड ऑर्बिटरप मास स्पेक्ट्रोमीटर की मदद से दूर किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोमीटर में एमएस1 स्तर पर एक डाइमेथाइलेटेड जोड़ी में एक चोटी को अलग करके हस्तक्षेप प्रभाव को दूर किया जा सकता है, जो प्रकाश या भारी चोटी को रैखिक आयन जाल में एमएस2 विखंडन के अधीन करता है और फिर मात्रात्मक जानकारी प्राप्त करने के लिए एचसीडी-एमएस3 के लिए सबसे तीव्र एमएस2 टुकड़ा को अधीन करता है। रिपोर्टर आयनों को उत्पन्न करने के लिए उपलब्ध lysine अमीनों के बिना पेप्टाइड्स का चयन करने की संभावना को बढ़ाने के लिए, वाई-1 टुकड़े के आधार पर एक चयनात्मक एमएस 3अधिग्रहण का भी उपयोग किया जा सकता है और यह एक दृष्टिकोण है जिसके परिणामस्वरूप सीपीपाइट9के साथ पेप्टाइड्स क्वांटिटिफायर का उच्च प्रतिशत हो सकता है। प्रकाश और भारी लेबलिंग के संयोजन से नमूना मल्टीप्लेक्सिंग क्षमताओं को 2x के कारक द्वारा बढ़ाया जाता है जो व्यक्तिगत आइसोकरिक टैग के साथ हासिल किया जाता है। हमने हाल ही में16DiLeu reagents के साथ एक ही प्रयोग में 24 नमूनों को मिलाने के लिए cPILOT का इस्तेमाल किया है । इसके अतिरिक्त cPILOT का उपयोग प्रोटीन नाइट्रेट17, अन्य वैश्विक प्रोटेक्स9सहित ऑक्सीडेटिव पोस्ट-ट्रांसलेशनल संशोधनों का अध्ययन करने के लिए किया गया है, औरअल्जाइमररोग माउस मॉडल11में कई ऊतक नमूनों में अनुप्रयोगों का प्रदर्शन किया गया है।
मजबूत नमूना तैयारी एक cPILOT प्रयोग में एक महत्वपूर्ण कदम है और समय लेने वाली, श्रमसाध्य, और व्यापक हो सकता है। उन्नत नमूना मल्टीप्लेक्सिंग के लिए व्यापक पाइपिंग और अत्यधिक कुशल प्रयोगशाला कर्मियों की आवश्यकता होती है, और ऐसे कई कारक हैं जो प्रयोग की प्रजनन क्षमता को भारी प्रभावित कर सकते हैं। उदाहरण के लिए, नमूनों की सावधानीपूर्वक हैंडलिंग सभी नमूनों के लिए समान प्रतिक्रिया समय सुनिश्चित करने और प्रकाश और भारी डाइमेथाइलेटेड नमूनों के लिए उपयुक्त बफर पीएच बनाए रखने के लिए आवश्यक है। इसके अलावा, सैकड़ों नमूनों के लिए दसियों की मैनुअल तैयारी उच्च प्रयोगात्मक त्रुटि शुरू कर सकते हैं । इसलिए, नमूना तैयारी परिवर्तनशीलता को कम करने, मात्रात्मक सटीकता में सुधार करने और प्रयोगात्मक थ्रूपुट को बढ़ाने के लिए, हमने एक स्वचालित cPILOT कार्यप्रवाह विकसित किया। ऑटोमेशन एक रोबोट लिक्विड हैंडलिंग डिवाइस का उपयोग करके हासिल किया जाता है जो वर्कफ़्लो(चित्रा 1)के कई पहलुओं को पूरा कर सकता है। प्रोटीन क्वांटिफिकेशन से पेप्टाइड लेबलिंग तक सैंपल तैयार करने का काम एक ऑटोमेटेड लिक्विड हैंडलर पर किया गया था । स्वचालित तरल हैंडलर ठोस चरण निष्कर्षण (एसपीई) प्लेटें, कक्षीय शेखर, और एक हीटिंग/कूलिंग डिवाइस के बीच बफर एक्सचेंजों के लिए एक सकारात्मक दबाव उपकरण (पीपीए) के साथ एकीकृत है । रोबोटिक प्लेटफॉर्म में प्लेटों और बफ़र्स को समायोजित करने के लिए 28 डेक स्थान शामिल हैं। डेक स्थानों के भीतर प्लेटों को स्थानांतरित करने के लिए एक तवे के साथ दो फली हैं: एक 96-चैनल फिक्स्ड वॉल्यूम पाइपटिंग हेड (5-1100 माइक्रोएल) और 8 चैनल वेरिएबल वॉल्यूम प्रोब्स (1-1000 माइक्रोन)। रोबोटिक प्लेटफॉर्म को एक सॉफ्टवेयर का उपयोग करके नियंत्रित किया जाता है। रोबोट लिक्विड हैंडलर का उपयोग करने से पहले उपयोगकर्ता को पेशेवर रूप से प्रशिक्षित करने की आवश्यकता है। वर्तमान अध्ययन मैनुअल cPILOT कार्यप्रवाह को स्वचालित करने पर केंद्रित है, जो एक ही बैच में 12 से अधिक नमूनों को संसाधित करने के लिए श्रम गहन हो सकता है। cPILOT दृष्टिकोण 11 के थ्रूपुट को बढ़ाने के लिए, हमने समानांतर में10से अधिक नमूनों को संसाधित करने के लिए एक रोबोट तरल हैंडलर को cPILOT प्रोटोकॉल स्थानांतरित कर दिया। स्वचालन नमूना तैयारी प्रक्रिया के विभिन्न चरणों के दौरान समानांतर में प्रत्येक नमूने के लिए समान प्रतिक्रियाओं की भी अनुमति देता है, जिसके लिए मैनुअल cPILOT के दौरान उच्च प्रशिक्षित उपयोगकर्ताओं को प्राप्त करने की आवश्यकता होती है। यह प्रोटोकॉल cPILOT को पूरा करने के लिए स्वचालित तरल हैंडलिंग डिवाइस के कार्यान्वयन पर केंद्रित है। वर्तमान अध्ययन इस स्वचालित प्रणाली का उपयोग करने के लिए प्रोटोकॉल का वर्णन करता है और माउस लिवर होममोजेनेट के 22-प्लेक्स “प्रूफ-ऑफ-कॉन्सेप्ट” विश्लेषण का उपयोग करके इसके प्रदर्शन को दर्शाता है।
cPILOT एक बढ़ी हुई मल्टीप्लेक्सिंग रणनीति है जो एक ही प्रयोग में 24 नमूनों का विश्लेषण कर सकती है। मल्टीप्लेक्सिंग क्षमता उपलब्ध आइसोटोपिक और आइसोबाइक टैगिंग संयोजनों की संख्या पर निर्भर करती है। टीएमटीपीआरओ7का परिचय, जो एकल प्रयोग में 16 नमूनों को टैग करने में सक्षम है, cPILOT की सीमा को 32-प्लेक्स तक धकेल सकता है। cPILOT में कई पाइपिंग चरण होते हैं और नमूना तैयारी करने के लिए व्यापक देखभाल और उपयोगकर्ता कौशल की आवश्यकता होती है। यहां तक कि एक विशेषज्ञ उपयोगकर्ता के साथ, मैनुअल त्रुटियां अपरिहार्य हैं, जो cPILOT रणनीति में नमूनों को संसाधित करने के लिए रोबोट प्लेटफार्मों के उपयोग को आमंत्रित करती हैं। चूंकि सीपीआईएलटी पेप्टाइड्स की पीएच निर्भर टैगिंग का उपयोग करता है, इसलिए पीएच को प्रकाश और नमूनों के भारी डाइमेथाइलेटेड सेट के लिए बनाए रखने की आवश्यकता होती है। हल्का अम्लीय-बुनियादी पीएच दोनों एन-टर्मिनी और lysine अवशेषों के डाइमेथिलेशन में परिणाम कर सकते हैं । CPILOT का एक लाभ यह है कि इसके लिए केवल आधे आइसोआरिक टैग की आवश्यकता होती है क्योंकि पेप्टाइड एन-टर्मिनी डिमेथिल समूहों के साथ कब्जा कर लिया जाता है। यह आधी लागत पर लेबल किए जाने वाले नमूनों की एक बड़ी संख्या प्रदान करता है । बड़े नमूना संख्या को संभालने के लिए आवश्यक है कि अभिकर् ता जोखिम समय एक बैच में पहले और अंतिम नमूने के लिए समान हैं। एक पिपेट डिस्पेंसर जो समानांतर में 32 नमूनों को समायोजित कर सकता है, रोबोट तरल हैंडलिंग उपकरणों के उपयोग के साथ सबसे अच्छा प्राप्त किया जा सकता है।
CPILOT द्वारा कई नमूनों को संसाधित करने के लिए, स्वचालन को शामिल करने के लिए मैनुअल वर्कफ्लो में संशोधन किया गया था। इस अध्ययन में इस्तेमाल किया रोबोट तरल हैंडलर ९६ चैनल और 8 चैनल pipetting क्षमताओं के साथ दो फली है, एक तवे के साथ उपलब्ध 28 डेक स्थानों में प्लेटों जगह है । तरल हैंडलर एक सकारात्मक दबाव उपकरण, कक्षीय शेखर, और ९६ अच्छी तरह से थाली में गर्मी/शांत नमूनों के लिए एक उपकरण के साथ एकीकृत है । सकारात्मक दबाव तंत्र सफाई के दौरान एसपीई प्लेटों में बफर एक्सचेंजों को करने में मदद करता है, जबकि कक्षीय शेखर नमूनों को भंवर/मिश्रण करने में मदद करता है । रोबोटिक प्लेटफॉर्म को ९६-अच्छी प्लेटों, इनक्यूबेट, भंवर के नमूनों और ट्रांसफर प्लेटों के लिए बफ़र्स और नमूनों को एस्पिरेट और बांटने के लिए प्रोग्राम किया गया था । विभिन्न चिपचिपाहट वाले तरल पदार्थ, जैसे एसीटोनीट्रिल और पानी, विशिष्ट पाइपिंग विचारों की आवश्यकता होती है जिन्हें विधि में प्रोग्राम भी किया जा सकता है।
पीसीपायलट वर्कफ्लो, बीसीए द्वारा प्रोटीन क्वांटिफिकेशन से शुरू होकर आइसोकर्क टैग (यानी टीएमटी) के साथ पेप्टाइड्स को लेबल करने के लिए लिक्विड हैंडलर सिस्टम पर किया गया था । पूर्ण प्रोटोकॉल को 96 गहरी अच्छी प्लेटों का उपयोग करने के लिए बढ़ाया गया था जो प्रति अच्छी तरह से 2 एमएल पकड़ सकते हैं। बफर को प्रयोग की शुरुआत से पहले तैयार किया गया था और 96 अच्छी प्लेट में जोड़ा गया था ताकि समानांतर नमूना प्रसंस्करण की अनुमति दी जा सके। वर्तमान अध्ययन में, माउस लिवर समरूप के 22 कार्यप्रवाह प्रतिकृति गहरी अच्छी तरह से प्लेटों में जोड़े गए और सीपीएएलटी प्रोटोकॉल के माध्यम से लिया गया। अंत में, 22-प्लेक्स इक्विमोलर माउस लिवर टैग पेप्टाइड्स से मिलकर एक नमूना मास स्पेक्ट्रोमीटर को इंजेक्ट किया गया था। नमूनों में पेप्टाइड बहुतायत के अनुरूप रिपोर्टर आयन तीव्रता से पता चला है कि तरल हैंडलर के साथ संसाधित नमूनों में मैनुअल प्रोटोकॉल(डेटा नहीं दिखाए गए)की तुलना में कम सीवी होते हैं। रोबोटिक प्लेटफॉर्म ने नमूना प्रसंस्करण की प्रजनन क्षमता में भी काफी सुधार किया। बड़ी संख्या में नमूनों को संसाधित करते समय प्रजनन क्षमता और मजबूती बहुत महत्वपूर्ण कारक हैं। पाइपिंग त्रुटियों से डेटा की गलत व्याख्या पूरी हो सकती है और यहां रोबोटिक प्लेटफॉर्म ने कम अंतर-नमूना भिन्नता प्रदान की है। इसके अलावा cPILOT के लिए रोबोट मंच का उपयोग नमूने तैयार करने के लिए आवश्यक समय कम । उदाहरण के लिए, स्वचालित विधि विकसित करने के बाद, मैनुअल cPILOT के लिए 7.5 घंटे की तुलना में 22 नमूनों को संसाधित करने के लिए 2.5 घंटे की आवश्यकता होती है। मैनुअल और स्वचालित cPILOT कार्यप्रवाह की तुलना का मूल्यांकन करने के लिए हमारी प्रयोगशाला में प्रयोग चल रहे हैं। हमारी प्रयोगशाला से पिछली रिपोर्टों के आधार पर, मैनुअल cPILOT में प्रोटीन रिपोर्टर आयन तीव्रता के सीवी% इस मूल्य 12 से अधिक कुछ outliers के साथऔसतन 20%थे ।
cPILOT पेप्टाइड स्तर पर एक रासायनिक व्युत्पन्न रणनीति है, जिसका उपयोग कोशिकाओं, ऊतकों और शरीर के तरल पदार्थ जैसे किसी भी नमूना प्रकार के लिए किया जा सकता है। CPILOT बढ़ाया नमूना मल्टीप्लेक्सिंग प्रदान करता है और स्वचालन के समावेश के साथ प्रोटेओमिक्स में उच्च थ्रूपुट नमूना मल्टीप्लेक्सिंग की सुविधा प्रदान कर सकते हैं। यह थ्रूपुट रोग और जैविक समझ और बायोमार्कर खोज को आगे बढ़ाने के लिए आवश्यक है।
The authors have nothing to disclose.
लेखक वैंडरबिल्ट विश्वविद्यालय स्टार्ट-अप फंड और एनआईएच पुरस्कार (R01GM117191) को आरएएसआर को स्वीकार करते हैं।
0.6 mL eppendorf tubes, 500 pk | Fisher Scientific | 04-408-120 | Any brand of 0.6 mL eppendorf tubes are sufficient |
0.65 µm Ultrafree MC DV centrifugal filter units | EMD Millipore | UFC30DV00 | |
1.5 mL eppendorf tubes, 500 pk | Fisher Scientific | 05-408-129 | Any brand of 1.5 mL eppendorf tubes are sufficient |
2 ml black deep well plate | Analytical Sales and Services, Inc. | 59623-23BKGC | Any brand of black 96-well plate is sufficient |
2 ml clear deep well plate | VWR | 75870-796 | |
Acetic Acid | J.T. Baker | 9508-01 | |
Acetonitrile – MS Grade | Fisher Scientific | A955-4 | 4 L quantity is not necessary |
Agilent 500µL plate | Agilent | 203942-100 | Reagent plate for adding buffers |
Ammonium formate | Acros Organics | 208-753-9 | |
Ammonium hydroxide solution (28 – 30%) | Sigma Aldrich | 320145-500ML | |
Analytical balance | Mettler Toledo | AL54 | |
BCA protein assay kit | Pierce Thermo Fisher Scientific | 23227 | |
Biomek i7 hybrid | Beckmann | Any liquid handling device with ability to use positive pressure, heating/cooling and Vortex the samples. | |
C18 packing material (2.5 µm, 100 Å) | Bruker | This item is no longer available from Bruker. Alternative packing material with listed specifications will be sufficient | |
Centrifuge with plate rotor | Thermo Scientific | 69720 | |
Micro 21R Centrifuge | Sorval | 5437 | |
Dionex 3000 UHPLC | Thermo Scientific | This model is no longer available. Any nano LC with an autosampler is sufficient. | |
Dithiothreiotol (DTT) | Fisher Scientific | BP172-5 | |
Formaldehyde (13CD2O) solution; 20 wt % in D2O, 98 atom % D, 99 atom % 13C | Sigma Aldrich, Chemistry | 596388-1G | |
Formaldehyde (CH2O) solution; 36.5 – 38% in H2O | Sigma Aldrich, Life Science | F8775-25ML | |
Formic Acid | Fluka Analytical | 94318-250ML-F | |
Fusion Lumos Mass Spectrometer | Thermo Scientific | This model is no longer available. Other high resolution instruments (e.g. Orbitrap Elite, Orbitrap Fusion, or Orbitrap Fusion Lumos) can be used. | |
Hydroxylamine hydrochloride | Sigma Aldrich, Chemistry | 255580-100G | |
Iodoacetamide (IAM) | Acros Organics | 144-48-9 | |
Isobaric Tagging Kit (TMT 11-plex) | Thermo Fisher Scientific | 90061 | |
L-1-tosylamido-2 phenylethyl cholormethyl ketone (TPCK)-treated Trypsin from bovine pancreas | Sigma Aldrich, Life Science | T1426-100MG | |
L-Cysteine | Sigma Aldrich, Chemistry | 168149-25G | |
Mechanical Homogenizer (i.e. FastPrep-24 5G) | MP Biomedicals | 116005500 | |
pH 10 buffer | Fisher Scientific | 06-664-261 | Any brand of pH buffer 10 is sufficient |
pH 7 buffer | Fisher Scientific | 06-664-260 | Any brand pH buffer 7 is sufficient |
pH meter (Tris compatiable) | Fisher Scientific (Accumet) | 13-620-183 | Any brand of a pH meter is sufficient |
Protein software (e.g. Proteome Discoverer) | Thermo Scientific | ||
Reservior plate 200ml | Agilent | 204017-100 | |
Sodium Cyanoborodeuteride; 96 atom % D, 98% CP | Sigma Aldrich, Chemistry | 190020-1G | |
Sodium Cyanoborohydride; reagent grade, 95% | Sigma Aldrich | 156159-10G | |
Speed-vac | Thermo Scientific | SPD1010 | any brand of speed vac that can accommodate a deep well plate is sufficient |
Stir plate | VWR | 12365-382 | Any brand of stir plates are sufficient |
Targa 20 mg SPE plates | Nest Group, Inc. | HNS S18V | These are C18 cartridges |
Triethyl ammonium bicarbonate (TEAB) buffer | Sigma Aldrich, Life Science | T7408-100ML | |
Tris | Biorad | 161-0716 | |
Biomek 24-Place Tube Rack Holder | Beckmann | 373661 | |
Urea | Biorad | 161-0731 | |
Water – MS Grade | Fisher Scientific | W6-4 | 4 L quantity is not necessary |