결합된 전구체 이소토픽 라벨링 및 동서성 태그(cPILOT)를 사용하여 자동화된 샘플 멀티플렉스

모든 동물 프로토콜은 피츠버그 대학의 기관 동물 관리 및 사용 위원회의 승인을 받았습니다. 한 남성 제어 마우스 (C57/BLJ) 상업적으로 구입 하 고 피츠버그 대학에서 실험실 동물 자원의 부서에 보관. 마우스는 표준 설치류 실험실 차우 광고 리비툼을 공급하고 12 h 빛 / 어두운 주기에 보관하였다. 간 조직은 수확하여 -80 °C에 저장하였다. 1. 단백질 추출 참고: 이러한 단계는 수동으로 수행됩니다. 용액 매트릭스 A 비드를 사용하여 기계적 균질화기를 사용하여 8M 우레아의 500 μL을 식염수와 균질화한 마우스 간(100 mg)을 세척하여 20s용 4m/s에 사용할 수 있습니다.참고: 본 연구에서, 프로테아제 또는 인산억제제는 첨가되지 않았지만 실험에 기초하여 필요한 경우 완충제에 첨가될 수 있다. 또한, 단백질 추출 단계는 다양한 샘플 유형에 따라 조정할 수 있다. 새로운 마이크로센심분리기 튜브로 균형화 조직을 옮기고, 헹구고, 용액튜브를 PBS의 100-500 μL과 8M 우레아로 결합한다. 원심분리기균화된 조직(12,800 x g,4°C 및 15분)을 수집하고 상류체를 수집한다.참고: 나머지 단계는 사용자 실험실에서 사용할 수 있는 로봇 액체 처리기에서 수행됩니다. 액체 처리기는 작업자참여가 최소화된 ANCI 지정 플레이트 유형에서 버퍼를 흡입하고 분배할 수 있어야 합니다. 제조 업체의 지침에 따라 bicinchoninic acid (BCA) 분석기를 사용 하 여 단백질 농도를 결정 합니다. PPA, 가열/냉각 장치 및 진공 펌프를 켜고 모든 액세서리를 액체 처리기와 연결합니다. 액체 처리기는 컴퓨터에 연결되어 작동할 준비가 되면 파란색 표시등을 표시합니다. 시약 플레이트 1(96웰 플레이트)은 각각 25mM 1,4-디티오트리톨(DTT), 시스테인 25m MM 30 μL, 25mMM 30 μL, 이오도아세타미드(IAA)의 25mM 30 μL을 각각 1, 2, 3행에 추가한다. 저수지 플레이트에 8M 우레아와 20m 트라이를 10mM CaCl 2(pH 8.2)로 넣습니다. 5mL의 500 μL을 2mL 깊이 의 우물 판에 넣고 트립신 플레이트 20 μL을 넣고 방법에 의해 지정된 대로 갑판 위치에 배치하십시오.참고: IAA와 트립신은 시료에 첨가하기 전에 96웰 플레이트에 첨가하였다. 간의 알리쿼트 300 μL은 500 μL 튜브로 동형화되어 2mL 깊이의 우물 판에 놓고 프로토콜이 시작될 때까지 4°C에 놓습니다. 이 실험을 위해, 22 개의 알리쿼트가 단일 간 균주에서 생성되었다.참고: 내부 품질 관리 표준(예: 소 알파 카제인 또는 기타 외인성 단백질)을 비율 1 μg 표준: 100 μg 단백질 샘플로 추가합니다. 테이블 1에따라 가변 이름과 값으로 샘플에 추가할 버퍼 볼륨을 정의합니다. BCA에 기초하여 스프레드시트에 샘플 및 정규화 버퍼(8M urea)의 부피를 입력하고소프트웨어(표 2)에부착한다.참고: 단백질 농도가 너무 높으면 완충액을 추가로 희석해야 할 수 있습니다. 간 조직에서 샘플에 대한 결과 농도는 10 μg/μL이었다. 완충제의 양은 100 μg 단백질에 최적화되었다. 4°C에서 샘플 튜브를 제거하고, 자동 액체 처리기의 지정된 데크 위치에 배치하고, 10 분 동안 따뜻하게 할 수 있습니다. 메서드를 열고 지침에 따라 필요한 팁(1070, 90 및 230 μL) 및 랩웨어를 원하는 위치에 배치합니다. 모든 labware와 팁이 제자리에 있으면 최종 덱 레이아웃을 교차 확인하고 다음을 클릭하여 프로토콜을 계속합니다.참고: 가이드 설정은 유지될 프로토콜 및 데크 위치에 따라 특정 랩웨어에 필요한 버퍼 볼륨을 추가하도록 사용자에게 알립니다. 2. 샘플 감소, 알킬레이션 및 소화 230 μL 팁을 적재하고 저수지에서 8M 우레아의 90 μL을 흡인하고 검은 색 2 mL 깊이 우물 플레이트의 행 1에 분배합니다. 팁을 언로드합니다. 8M 우레아가 22개의 샘플에 해당하는 모든 우물에 추가될 때까지 이 단계를 반복한다.참고: 데나션 버퍼는 단백질 3차원 구조를 풀어 트립신이 단백질을 효과적으로 작용하고 분해할 수 있도록 1차 구조를 산출합니다. 8채널 파이펫은 8채널에 대해 서로 다른 볼륨을 흡인할 수 있으며 랩웨어의 다른 위치에 분배할 수 있습니다. 이 단계에서 모든 채널은 소프트웨어에 정의된 것과 동일한 볼륨을 흡인시켰습니다. 데나처레이션 버퍼를 추가한 후, 8채널 파이펫을 사용하여 마우스 간 균형의 90 μL 팁과 흡인 10 μL(100 μg에 해당)을 블랙 2 mL 딥 웰 플레이트에 적재한다. 팁을 언로드합니다. 모든 22개의 샘플이 전송될 때까지 이 단계를 반복합니다. 각 전달 후, 1:1 비율을 나타내기 위해 단백질을 완충액과 혼합할 수 있도록 잘 내용물의 50 μL을 흡인하고 분배하는 혼합 단계를 수행한다.참고 : 재고 균형 샘플을 제거하고 -80 ° C에 배치합니다. 변성 단백질을 줄이기 위해 시약 판 1에서 90 μL 팁의 한 행을 적재하고 DTT의 3 μL을 흡인합니다. DTT를 블랙 2mL 딥 웰 플레이트의 1과 2열로 분배하고 팁을 언로드합니다.참고: 단백질: DTT 어금니 비율은 이황화물 결합의 감소를 위해 1:40에 유지됩니다. 어금니 비율에 대한 계산은 66.5 x 103 g/mol인 소 혈청 알부민(BSA)의 단백질 질량을 기반으로 합니다. 300 rpm에서 37 °C에서 37 °C에서 알루미늄 호일로 샘플 플레이트를 밀봉하십시오. 사용 직전에 시약 플레이트 1의 3열에 0.25 M IAM의 30 μL을 추가하고 갑판에 놓습니다. 샘플 플레이트의 봉인을 풀고 갑판으로 돌아갑니다.참고: IAM은 빛에 민감합니다. 90 μL 팁의 한 행을 로드하고, 시약 판 1에서 IAM의 6 μL을 3행에서 흡면하고, 샘플 플레이트의 1행으로 분배한다. 팁을 언로드합니다.참고: 단백질: IAM 어금니비는 각 시료에 대해 1:80에 유지됩니다. 이 반응은 어둠 속에서 이루어져야 합니다. 시료 판을 밀봉하고 가열/냉각 장치에서 300rpm에서 30분 동안 4°C에서 배양하십시오.참고 : 플레이트를 밀봉하면 샘플이 빛, 증발 및 우물에서 유출되는 것을 방지하기 위해 수행됩니다. 샘플 플레이트의 봉인을 풀고 90 μL 팁의 한 행을 로드하고 2행2에서 시약 판 1에서 시스테인 5 μL을 흡인합니다. 샘플 플레이트의 1과 2 행에 분배하고 팁을 언로드합니다. 실온에서 30분 동안 배양하십시오.참고: 단백질: L-시스테인 어어 비율은 1:40에 유지됩니다. 시료 판을 궤도 셰이커에 놓고 30분 동안 1800rpm의 시간 제비 쉐이크를 수행합니다. 20m TS 버퍼의 800 μL을 샘플 플레이트의 각 웰에 10mM CaCl2(pH 8.2)를 추가하여 우레아 농도를 2M로 희석하여 팁을 언로드합니다.참고: 트립신 활동은 더 높은 우레아 농도에서 방해되므로 2M 미만으로 감소해야 합니다. 이 연구는 50: 14h의 트립신 어금니 비율을 트립신 어금니 비율로 수행하였다. 트립신 20 μL을 행 1에 넣고, 96개의 웰 플레이트의 열 1-12를 추가하고 갑판에 지정된 위치에 놓습니다. 90 μL 팁의 한 행을 로드하고, 트립신 플레이트 행 1에서 트립신 2 μL을 흡인하고, 샘플 플레이트의 행 1과 2로 분배합니다. 팁을 언로드합니다. 플레이트를 밀봉하고 가열/냉각 장치에서 600rpm에서 37°C에서 14시간 동안 배양합니다. 인큐베이션 후, 샘플 플레이트를 봉인 해제하고 행 3, 깊은 우물 수집 플레이트의 열 1- 12에 5 % 포릭 산을 추가하고 지정된 갑판에 배치합니다. 포믹산판 3행으로부터 5% 포믹산의 150 μL을 첨가하여 소화를 멈추고 1열과 2열에서 시료판에 분배한다. 팁을 언로드합니다. 3. 탈염 단계 1 타르가 C-18 물질의 20 mg을 포함하는 SPE 플레이트로 펩티드를 탈염. 모든 버퍼 교환의 체적을 600 μL로 수정하고 압력을 100mbar로 수정합니다. 1070 μL 팁을 적재하고 아세토닐릴600 μL을 흡인하고 SPE 플레이트 1과 2행에 분배합니다. SPE 플레이트를 PPA에 놓고 압력을 가합니다. 동일한 팁을 사용하여 아세토닐릴60μL을 흡인하고 SPE 플레이트 1과 2행으로 분배합니다. SPE 플레이트를 PPA에 놓고 압력을 가합니다.참고: 유동은 흡입 펌프를 사용하여 낭비하도록 배수할 수 있습니다. 1070 μL 팁과 버퍼 A의 흡면 600 μL(0.1% 포믹산의 100% 물)을 적재하고 SPE 플레이트 1과 2행에 분배합니다. SPE 플레이트를 PPA에 놓고 압력을 가합니다.참고: 버퍼의 부피가 크게 감소하지 않으면 압력이나 시간을 크게 늘려보십시오. 1070 μL 팁의 2 행을 적재하고, 소화된 시료의 534 μL을 흡인하고, SPE 플레이트 1과 2행에 분배합니다. SPE 플레이트를 PPA에 놓고 압력을 가합니다. 모든 샘플이 로드될 때까지 이 단계를 반복합니다.참고: 포믹산을 첨가한 후 총 부피가 1068μL이 되고 시료가 두 번의 패스에 추가되기 때문에. 사용된 1070 μL 팁의 2행을 적재하고, 버퍼 A의 600 μL을 흡인하고, SPE 플레이트 1과 2행에 분배합니다. SPE 플레이트를 PPA에 놓고 압력을 가합니다. 위의 단계를 한 번 반복하여 샘플을 청소합니다. 1열 1070 μL 팁, ACN 의 600 μL 을 흡인합니다: 물(60:40) 및 SPE 플레이트 1과 2행에 분배합니다. SPE 플레이트를 수집 판 위에 놓고 PPA를 사용하여 펩티드를 엘테우하고 압력을 가합니다. 상기 단계를 반복하여 수집 판에서 펩티드를 엘로트한다. 수집 판을 건조시키고 추가 처리가 될 때까지 -80 ° C로 보관하십시오. 4. 디메틸화 라벨링(펩타이드 N-테르미니) 필요한 팁(1070, 90 및 230 μL)과 랩웨어를 소프트웨어의 원하는 위치에 배치합니다. 모든 labware와 팁이 제자리에 있으면 최종 덱 레이아웃을 교차 확인하고 다음을 클릭하여 프로토콜을 계속합니다. 시약 플레이트 2에, 1 % 아세트산의 450 μL, 50 μL 라이트 포름알데히드 (CH2O), 무거운 포름 알데히드(13CD 2O), 및 1,2,3 및 4 행에 포름산의 150 μL을 추가합니다. 시약 플레이트 3은 50 μL의 빛 CB, 무거운 CB의 50 μL을 암모니아의 행 1 과 2 및 50 μL에 3 및 4 행에 추가합니다. 230 μL 팁의 2행을 적재하고 시약판 2의 1열에서 1% 아세트산1%의 아세트산을 흡인하고, 샘플 플레이트 2(탈염 단계로부터 의한 수집판)에서 말린 펩티드에 분배하고 1800rpm에서 5분 동안 시간적 흔들림을 수행한다. 적재 90 μL 팁과 흡인 16 μL 60 mM (4%) CH2O (37% wt/v) 시약 플레이트 2의 행 2에서 샘플 플레이트의 행 1에 분배한다. 팁을 언로드합니다. 90 μL 팁의 1 행로드 및 흡인 16 μL 60 mM (4%) 13 CD2O (20% wt/v) 시약 플레이트 2의 행 3에서 샘플 플레이트의 행 2에 분배한다. 팁을 언로드합니다.참고: 이 스터디 행 1은 빛과 행 2에 해당하며 무거운 절제된 샘플에 해당합니다(그림 1참조). 90 μL 팁의 2행과 흡면 16 μL의 2열은 24m NaBH3CN 및 24m NaBD3CN에서 시약 판 3의 행 1 과 2CN에서 각각 1 및 2행으로 분배한다. 팁을 내리고 궤도 셰이커를 사용하여 1800 rpm에서 15분 동안 시간 조정된 쉐이크를 수행합니다.참고: 시아노보로하이드라이드 나트륨을 첨가하면 이 단계가 일괄 처리당 한 번 수행되는 실험 간의 가변성을 감소시키기 위해 반응을 개시합니다. 90 μL 팁의 2행과 흡인 32 μL 1% 암모니아(~28-30% v/v)를 시약판 3행과 4개행에서 적재하고 샘플 플레이트 2의 1및 2열에 각각 분배한다. 팁을 언로드합니다.참고: 암모니아를 추가하면 반응이 중지되므로 실험 간의 가변성을 감소시켜 이 단계는 일괄 처리당 한 번 수행됩니다. 동일한 양의 빛과 무거운 (1:1) 디메틸화 된 펩타이드를 새로운 2 mL 깊이의 우물 판에 결합하여 탈염을 합니다.참고: 이 연구에서행 1에서 의 우물 내용물의 90 μL은 샘플 플레이트 2에서 새로운 2mL 수집 플레이트(샘플 플레이트 3)까지 행 2의 90 μL과 결합되었다. 빛의 비율: 무거운 혼합은 실험 프로토콜에 따라 다르며, 이 연구에서는 1:1 비율이 사용되었다. 230 μL 팁의 2 행을 적재하고 결합 된 샘플에 5 % 포믹 산의 32 μL을 흡인하고 1800 rpm에서 30 s에 대한 시간 적 흔들림을 수행합니다.참고: 디메틸화 효율은 반응 혼합물의 pH에 따라 달라지며 완충pH의 변화는 펩타이드 N-테르미니의 불완전한 라벨링을 초래할 것이다. 펩타이드 N-테르미니에서 동적 수정으로 검색할 때 디메틸화 효율은 97% 이상이어야 한다. 이 연구에서는 빛과 무거운 펩타이드의 라벨링 효율이 각각 99.7% 및 99.5%였다. 5. 탈염 단계 2 결합된 견본을 위한 디솔트 단계 1과 유사한 견본 탈염을 수행합니다. 속도 진공 을 사용하여 샘플 플레이트의 샘플을 건조하고 추가 처리 될 때까지 -80 °C에서 저장합니다. 6. 이소바릭 태그 (리스 잔류물) 가이드 랩웨어 설정을 따라 필요한 팁(1070, 90 및 230 μL)을 적절한 버퍼로 배치합니다. 모든 labware와 팁이 제자리에 있으면 최종 덱 레이아웃을 교차 확인하고 다음을 클릭하여 프로토콜을 계속합니다. 100m 트리에틸 암모늄 중탄산염(TEAB), 30 μL 의 하이드록실라민(10%w/v)을 1열에 넣고 시약판 42를 250μL에 추가합니다. 표 3의스프레드시트에 따라 2mL 깊이 플레이트에 TMT 튜브를 놓습니다. 태그된 펩티드를 풀링하기 위해 튜브 랙 홀더에 빈 1.5mL 튜브를 보관하십시오. 건조된 샘플 플레이트를 P9 및 TMT 처리 플레이트에 P14에 놓습니다. 펩티드를 재구성하기 위해, 230 μL 팁과 100 μL의 흡인 100 μL 100 μL 100 μL (TEAB) 버퍼 (pH ~8.5) TEAB 플레이트에서 열 1에서 1 행에서 건조 펩티드에 분배 3 샘플 플레이트 3. 1800 rpm에서 30 s의 궤도 셰이커에 플레이트를 놓습니다.참고: 1 μg/μL의 농도로 100 μg의 디메틸화 펩티드를 재구성합니다. TMT 플레이트의 H12에서 90 μL 팁과 흡인 10 μL의 분해10 μL을 건조 한 TMT 튜브각각에 분배합니다. TMT 튜브, 소용돌이를 제거하고 튜브를 빠르게 회전하고 깊은 우물 판으로 갑판으로 돌아갑니다. 90 μL 팁의 1행을 적재하고 합산 된 디메틸화 펩타이드의 12.5 μL을 흡인하고 TMT 처리 플레이트의 행 1에 분배합니다. 팁을 언로드합니다.참고: TMT: 펩티드 비율은 이 실험을 위해 1:8에서 유지되었다. 90 μL 팁의 1 행을 적재하고 TMT의 10 μL을 흡인하고 TMT 처리 플레이트의 행 1에 분배합니다. 팁을 내리고 1800 rpm에서 1 시간 동안 시간 조정 된 쉐이크를 수행합니다. 90 μL 팁의 1 행을 적재하고 TEAB 플레이트에서 2행에서 하이드록실라민(10% w/v)을 흡인하고 TMT 처리 플레이트의 행 1에 분배합니다. 팁을 내리고 1800 rpm에서 15 분 동안 시간 조정 된 흔들림을 수행합니다. TMT 프로세싱 플레이트에서 1.5mL 튜브에 TMT 표지 펩타이드의 30.5 μL을 결합합니다. 각 전송 후 팁을 언로드합니다. 풀이 된 샘플로 튜브를 제거하고 아세토닐을 증발시키기 위해 건조하십시오. 0.2mL의 물에서 펩티드를 0.1% 포름산으로 재구성하고 갑판으로 돌아갑니다.참고: 동종 태깅의 라벨링 효율은 pH에 특정하며 라벨링 효율은 제조업체의 지침당 98% 이상이어야 합니다. 본 연구에서는 리신의 TMT 라벨링 효율이 각각 99.4% 및 99.5%였다. 7. 탈염 단계 한 샘플에 대해 탈염 1과 유사한 시료 탈솔화를 수행합니다. 시료를 건조시키고 분석할 때까지 -80°C에 보관하십시오. 8. 액체 크로마토그래피 – 탠덤 질량 분광법 (LC-MS / MS) 및 MS3 MS 급수에서 펩티드를 0.1% FA로 재구성하여 ~1 μg/μL 농도를 얻습니다. 0.65 μm 필터를 포함하는 마이크로 센트심분리기 튜브로 샘플을 필터링합니다. 원심분리기 펩타이드는 12,000 x g에서 3분 동안 자동 샘플러 바이알로 흐름을 배치합니다.참고: 펩티드 농도는 원하는 경우 이 단계에서 확인할 수 있다. 펩티드는 LC-MS 급수에서 재구성되어야 하며 BCA 펩티드 분석의 대상이 될 것입니다. 이 연구에서는 펩타이드 BCA 분석이 수행되지 않았으며 모든 펩티드 양은 초기 단백질 BCA 분석에 기초했다. 다음과 같이 이동 상 버퍼를 준비하십시오 : 0.1 % FA (A)와 100 % ACN이있는 물 100 % (v / v)와 0.1 % FA (B)로. C18 재질 2cm(3 μm, 100 Å 모공 크기)로 포장된 트랩 컬럼에 1 μL의 샘플을 주입합니다.참고 : 트랩의 샘플 청소는 다음과 같습니다 : 10 분, 100 % A; 2ΜL/min 2D 액체 크로마토그래피 시스템을 사용하. 분석 분리 방법을 실행합니다. C18 재료 (2.5 μm, 100 Å)로 포장 된 100 μm i.d. x 26cm 레이저 당겨진 팁 융합 실리카 모세관 컬럼을 사용하십시오. 그라데이션은 0-10분, B 10%; 10-30 분, 10-15 % B; 30-75 분, 15-30% B; 75-88 분, 30-60% B; 88-92 분, 60-90 % B; 92-99 분, 90% B; 99-100 분, 90-10 % B, 100-120 분, 10 % B; 300 nL/분, 120 분. 분석 분리 방법이 실행되는 동안 질량 분광계에 대한 데이터 수집을 실행합니다. MS 측량 스캔에 대한 다음 매개변수를 사용하십시오: 375-1,500 m/z,120,000 해상도, 사이클 시간 3 s(최고 속도), 자동 게인 제어(AGC) 대상 4.0e5, 최대 주입 시간 50 ms. 이온 트랩을 사용하는 CID-MS/MS에 대해 다음과 같은 매개 변수를 사용합니다: 결과당 데이터 종속 수집(DDA) 스캔, 2m/z 격리 폭, 35% 정규화된 충돌 에너지(NCE), 0.25 활성화 Q, 10ms 활성화 시간, 1.0e4 AGC, 100ms 최대 주입 시간. HCD-MS3 SPS 10에 대한 다음 매개 변수를 사용: 스캔 범위 100-400 m/z,종속 스캔 수 10, AGC 5.0e4, 최대 사출 시간 118 ms, HCD 충돌 에너지 55%, MS2 격리 창 2. 9. 데이터 분석 적절한 데이터베이스에 대한 단백질 분석 소프트웨어를 사용하여 단백질 및 펩타이드 목록에 대해 생성된 RAW 파일을 검색합니다.참고: 이 연구에서 생성된 RAW 파일은 마우스 Uniprot 데이터베이스에 대해 검색되었습니다. 하나의 RAW 파일에 빛과 무거운 라벨이 모두 있기 때문에 가볍고 무거운 절제된 펩타이드에 대한 두 개의 워크플로우로 각 파일을 검색합니다. 마우스 Uniprot 데이터베이스 (07/13/2019)에 대 한 RAW 파일을 검색 53035 다음 매개 변수와 순서: 트립신 분열 최대 두 놓친 분열, 최소 6 개의 아미노산 길이, 15 ppm 부모 질량 내성, 1 다 단편화 허용 오차 정적 수정: 빛 디메틸화 (+28.031, 펩타이드 N-테르미누스) 또는 무거운 디메틸레이션 (+36.076 Da, 펩타이드 N-테르미누스), 카르바미도미틸 (+57.01 Da) C), 동적 수정: 산화 (+15.995 다, M), 11-플렉스 이소바릭 태그 (229.163 Da, K), 1 % FDR, 기자 이온 정량화 30 ppm 피크 통합 허용 오차, 통합 방법에 대한 가장 자신감 있는 센트로이드.참고: 무거운 디메틸화 피크는 또한 빛 동전 피크에서 ~7 Da (+35.069 Da, 펩타이드 N-terminus)인 또 다른 수정을 포함하고 따라서 다른 검색 노드도이 수정을 포함하도록 통합되어야한다. 강도에 따라 리포터 이온 정량화를 수행, 65% SPS 질량 일치, 평균 S/N 비율 10, 동위원소 보정, 정상화 및 스케일링이 수행되지 않았다.참고: 정규화 및 스케일링은 시료에 첨가된 총 펩티드 양 또는 특정 단백질에 기초하여 수행될 수 있다. QC 샘플은 두 꼬리 내부 참조 배율18을기반으로 배치 간 또는 배치 내 정규화를 위한 채널에 포함될 수도 있습니다. 다른 TMT 채널의 동위원소 오염은 검색에 제공되지 않았으며, 사용자는 상이한 리포터 이온의 동위원소 오염을 추가하는 것이 좋습니다.